原液稳定性补充

1重组人白细胞介素-12原液初步稳定性研究1.试验对象1.1实验对象广州市恺泰生物科技有限公司生产的重组人白细胞介素-12（rhIL-12）原液。1.2试验试剂及仪器见附录一。重组人白细胞介素-12（rhIL-12）原液批号为：20131120。2.试验内容2.1考察在生产贮存过程中对rhIL-12原液稳定性的影响因素rhIL-12的分离提纯都处于液体状态，这对蛋白分子极不稳定，纯化后需在低温（-80℃）冷冻贮存。在原液检测及生产成品过程中，需要在室温和2～8℃的条件下操作，并且样品需要自冷冻状态下解冻为溶液，故考察室温、2℃～8℃的条件下原液的稳定性及反复冻融对rhIL-12原液的蛋白含量、生物活性及纯度影响。试验过程中样品采用15ml无菌离心管包装，批号为20131120。2.1.1温度对rhIL-12原液稳定性的影响取样品分别放置于室温（实验室温度控制在21℃～26℃之间）、2℃～8℃（4℃冰箱）。室温放置的样品在第0h、1h、2h、4h、8h、24h、48h取样检测，4℃放置的样品在0d、1d、2d、3d、4d、5d、10d和15d时取样检测。进行样品的蛋白含量、生物活性、HPLC纯度和电泳纯度测定，并分析这四个指标随时间的变化情况，样品出现明显变化后，停止取样检测。2.1.2多次冻融对rhIL-12原液稳定性的影响rhIL-12原液在-80℃、4℃冻融多次，取样进行蛋白含量、生物活性、HPLC纯度和电泳纯度测定，并分析这四个指标随时间的变化情况。23.考察项目的检测方法3.1蛋白含量方法见附录四，参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》，蛋白含量标准应为0时的80%-120%。3.2生物活性具体步骤见附录二，参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》原液生物活性检定标准，以国际参考品作为参考品，计算比活性，检测各取样点比活性不低于0时比活性的80%为合格。3.3高效液相色谱法（HPLC）纯度检测HPLC纯度检测方法见附录三（二）。参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》原液纯度检定标准，纯度不低于95%为合格。3.4电泳法（非还原SDS-PAGE）纯度检测非还原SDS-PAGE纯度检测方法见附录五。参照13号申报材料《重组人白细胞介素-12制造和检定规程草案》原液纯度检定标准，纯度不低于95%为合格。3.3数据处理比较每批样品各取样点的蛋白含量、比活性和0时的蛋白含量、比活性，分析样品的蛋白含量和活性变化。用重复测量的方差分析法，比较样品随时间变化的蛋白含量和生物活性差异，多重比较采用LSD法。使用SPSS13.0软件进行处理，数据以XSD表示，显著性为P0.05。4.结果4.1影响因素试验结果4.1.1温度对rhIL-12原液影响不同温度条件下，各时间点样品的蛋白含量、生物活性和纯度的检测结果见表1、表2及附图1、图2、图3、图4。3表1.室温放置对rhIL-12原液蛋白含量、比活性及纯度影响结果（XSD，n=6）放置时间比活性（×106IU/mg）含量（ug/ml）HPLC纯度（%）电泳纯度（%）实测是否合格实测是否合格实测是否合格实测是否合格0h9.57±0.16合格198±18合格99.90合格99.9合格1h9.57±0.68合格197±13合格98.75合格99.9合格2h9.95±0.30合格198±20合格97.44合格99.9合格4h9.74±0.64合格190±09合格98.86合格99.9合格8h7.68±0.75**合格191±13合格98.56合格99.9合格24h6.55±0.23**不合格200±17合格99.00合格99.9合格48h4.35±0.32**不合格206±16合格98.92合格99.9合格注：**：与0h时比较P0.01。由表1可知，室温下放置的样品，与0时样品比活性相比，8h、24h和48h时样品的比活性有显著性差异（P0.01），而1h、2h和4h时的样品无显著性差异，说明rhIL-12原液室温条件下放置8h后比活性开始下降，但不低于0时比活性的80%，仍合格，至48h时已下降超过50%；样品在各个取样时间点的蛋白含量和纯度均合格。表2.4℃放置对rhIL-12原液蛋白含量、比活性及纯度影响结果（XSD，n=6）放置时间比活性（×106IU/mg）含量（ug/ml）HPLC纯度（%）电泳纯度（%）实测是否合格实测是否合格实测是否合格实测是否合格0d9.67±0.19合格204±18合格98.63合格99.9合格1d9.41±0.12合格199±13合格99.31合格99.9合格2d9.53±0.30合格199±20合格95.10合格99.9合格3d9.34±0.26合格193±10合格96.15合格99.9合格4d9.79±0.49合格198±07合格95.45合格99.9合格5d9.79±0.45合格199±14合格97.01合格99.9合格10d9.65±0.24合格204±15合格97.58合格99.9合格15d6.58±0.39**不合格190±09合格99.22合格99.9合格注：**：与0h时比较P0.01。由表2可知，与0时样品比活性相比，4℃放置10天之内的各时间点样品活性未出现显著下降（P0.05）；15d的样品比活性与0时相比有显著性差异（P0.01），低于0时比活性的30%以上，不合格。样品在各个取样时间点的蛋白含量和纯度均合格。4.1.2多次冻融对rhIL-12原液影响4rhIL-12经多次冻融后，其蛋白含量、生物活性和纯度的变化见表3和附图5、图6。由表3可知，与初始样品的比活性相比，rhIL-12原液在第5次冻融后有显著性差异（P0.01），说明rhIL-12经5次冻融后生物活性下降，与初始样品相比下降超过20%，6次冻融后比活性与初始样品相比下降30%；样品经6次冻融后蛋白含量及纯度均合格。表3.多次冻融对rhIL-12原液生物活性及纯度影响结果（XSD，n=6）冻融次数比活性（×106IU/mg）含量（ug/ml）HPLC纯度（%）电泳纯度（%）实测是否合格实测是否合格实测是否合格实测是否合格09.67±0.34合格197±11合格97.04合格99.9合格19.79±0.45合格185±11合格97.37合格99.9合格29.97±0.65合格198±17合格97.37合格99.9合格39.65±0.36合格190±08合格96.90合格99.9合格49.95±0.42合格188±17合格96.91合格99.9合格57.51±0.62**不合格206±15合格96.71合格99.9合格66.81±0.32**不合格193±10合格95.01合格99.9合格注：**：与冻融前比较P0.01。5.结论rhIL-12原液生物活性受温度影响较大，在生产过程中应尽量避免在高温环境下操作；多次冻融对rhIL-12的生物活性亦有较大影响，故其储存应考虑装量，尽量使每个包装的原液冻融后一次性用完，避免再次冻融造成失活和装量不合适造成浪费。5附图1-125℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置前）附图1-225℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置1h）6附图1-325℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置2h）附图1-425℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置4h）7附图1-525℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置8h）附图1-625℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置24h）8附图1-725℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置48h）9附图2-14℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置前）附图2-24℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置1天）10附图2-34℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置2天）附图2-44℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置3天）11附图2-54℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置4天）附图2-64℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置5天）12附图2-74℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置10天）附图2-84℃放置对rhIL-12原液HPLC纯度影响（放置15天）附图3-1反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响（冻融0次）13附图3-2反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响（冻融1次）附图3-3反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响（冻融2次）14附图3-4反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响（冻融3次）附图3-5反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响（冻融4次）15附图3-6反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响（冻融5次）16附图3-7反复冻融对rhIL-12原液HPLC纯度影响（冻融6次）17附图425℃放置对rhIL-12原液SDS-PAGE纯度影响备注：M蛋白标准1.25℃放置0小时；2.25℃放置1小时；3.25℃放置2小时；4.25℃放置4小时；5.25℃放置8小时；6.25℃放置24小时；7.25℃放置48小时18附图54℃放置对rhIL-12原液SDS-PAGE纯度影响备注：M蛋白标准1.4℃放置0天；2.4℃放置1天；3.4℃放置2天；4.4℃放置3天；5.4℃放置4天；6.4℃放置5天；7.4℃放置10天；8.4℃放置15天19附图6反复冻融对rhIL-12原液SDS-PAGE纯度影响备注：M蛋白标准；1.冻融0次；2.冻融1次；3.冻融2次；4.冻融3次；5.冻融4次；6.冻融5次；7.冻融6次；