原肌球蛋白4通过慢病毒重组体技术应用于脊髓损伤后的作用及机制研究随机对照实验方案

中国组织工程研究第20卷第37期2016–09–09出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchSeptember9,2016Vol.20,No.37ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5573·研究原著·罗夙医，女，1983年生，云南省昭通市人，汉族，2012年大理大学毕业，硕士，助教，主要从事微生物免疫研究。通讯作者：李劲涛，博士，副教授，昆明医科大学神经科学研究所，云南省昆明市650000中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)37-05573-07稿件接受：2016-07-26原肌球蛋白4通过慢病毒重组体技术应用于脊髓损伤后的作用及机制研究：随机对照实验方案罗夙医1，黄薇2，王晶3，王玺赟4，李劲涛3(昆明医科大学，1病原生物学与免疫学系，3神经科学研究所，42012级麻醉专业，云南省昆明市呈贡新区650500；2云南省第三人民医院神经内科，云南省昆明市650011)引用本文：罗夙医，黄薇，王晶，王玺赟，李劲涛.原肌球蛋白4通过慢病毒重组体技术应用于脊髓损伤后的作用及机制研究：随机对照实验方案[J].中国组织工程研究，2016，20(37):5573-5579.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.015ORCID:0000-0002-1661-9305(罗夙医)文章快速阅读：文题释义：原肌球蛋白：相对分子质量为64000，以大量异构体形式广泛分布于各种真核细胞中，最常见于骨骼肌细胞内，是肌动蛋白结合蛋白的一种。原肌球蛋白与肌动蛋白结合，位于肌动蛋白双螺旋的沟中，主要作用是加强和稳定肌动蛋白丝，抑制肌动蛋白和肌球蛋白结合，哺乳动物中的4个原肌球蛋白基因已被确认，分别命名为TPM1，TPM2，TPM3，TPM4。原肌球蛋白4(TPM4)的功能：TPM4有稳定F-肌动纤维的作用，在肌肉收缩的调节中发挥重要的作用。此外，TPM4作为一种仅次于其它细胞骨架肌动蛋白的一种有趣的候选蛋白，可在未成熟的神经元中调节转录，并与肌肉相关。TPM4的表达也在肿瘤中和神经系统被发现，不仅如此，据报道TPM4与神经轴突的生长和突触可塑性相关。摘要背景：前期研究采用2-DE/MALDI-TOF/MS方法，发现原肌球蛋白4在脊髓表达增加，但迄今为止，有关原肌球蛋白4与脊髓损伤的发病机制和进展的关系仍知之甚少。方法/设计：①随机对照动物实验：建立脊髓全横断损伤大鼠模型，通过2-DE双向电泳、氨基酸系列分析、q-PCR和Western-Blot方法明确脊髓横断损伤3-28d在损伤脊髓头侧原肌球蛋白4的表达变化。②基因水平的机制探索实验：用基于体外慢病毒重组体技术敲除原肌球蛋白4，研究其对体外培养的脊髓神经元树突生长长度的作用；并通过BBB评分法评估原肌球蛋白4敲除对脊髓横断损伤大鼠运动功能恢复的作用。讨论：实验结果拟为脊髓横断损伤后促进运动功能恢复的治疗提供一种基于慢病毒重组体为载体携带原肌球蛋白4干扰RNA的、新的、有效的分子治疗策略，并阐明其治疗作用机制，为临床脊髓全横断损伤的基因治疗开辟乐观的应用前景。伦理批准：研究经昆明医科大学医学伦理委员会批准，大鼠的外科操作和术后护理遵循中国实验动物保护和伦理委员会的规定，并与美国国立卫生与健康研究院的指南一致。关键词：组织构建；组织工程；原肌球蛋白4；脊髓损伤；基因敲除主题词：脊髓损伤；原肌球蛋白；基因敲除技术基金资助：云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项缩略语：原肌球蛋白4：Tropomyosin4，TPM4慢病毒重组体技术敲除原肌球蛋白4对脊髓全横断大鼠神经行为学变化及其对轴突外生作用的机制基于体外慢病毒重组体技术方法敲除TPM4脊髓全横断大鼠转染脊髓神经元BBB评分评估大鼠运动功能恢复应用LEICADMI6000B获得细胞影像检测细胞轴突长度罗夙医，等.原肌球蛋白4通过慢病毒重组体技术应用于脊髓损伤后的作用及机制研究：随机对照实验方案P.O.Box10002,Shenyang110180:LiJin-tao,M.D.,Associateprofessor,InstituteforNeuroscience,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,YunnanProvince,ChinaEffectsoftropomyosin4appliedinspinalcordinjuriesvialentiviralvectorrecombinationandtheunderlyingmechanism:studyprotocolforarandomizedcontrolledtrialLuoSu-yi1,HuangWei2,WangJing3,WangXi-yun4,LiJin-tao3(1DepartmentofPathogenicBiology&Immunology,3InstituteforNeuroscience,4DepartmentofAnesthesiologyGrade2012,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,YunnanProvince,China;2DepartmentofNeurology,theThirdPeople’sHospitalofYunnanProvince,Kunming650011,YunnanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Tropomyosin4levelhasbeenfoundtobeanincreaseinthespinalcordbasedonthe2-DE/MALDI-TOF/MSmethod.However,thereislittlereportabouttherelationshipbetweentropomyosin4andpathogenesisandprogressofspinalcordinjuries.METHODS/DESIGN:Randomizedcontrolledtrial:ratmodelsofcompletespinalcordtransectionweremadeandexpressionlevelsoftropomyosin4at3-28daysaftermodelingweredeterminedbytwo-dimensionalelectrophoresis,animoacidserieanalysis,quantitativePCRandwesternblot.Experimentforexporingthegeneticmechanism:effectsoftropomyosin4scilencingbylentivirusrecomninationtechnologyonthedendritelengthofspinalcordneuronsinvitrowereobserved,anditseffectsontheneurologicalfunctionofratsaftercompletespinalcordtransactionwereassessedthroughBasso,Beattie,andBresnahanscoring.DISCUSSION:Thisstudywillbepoweredtoprovideanovelandeffectivetreatmentstrategyforneurologicalfunctionrecoveryafterspinalcordtransectionbasedonthelentivirusrecomninationcarryingtropomyosin4,aswellasoptimisticfutureforclinicalgenetreatmentofcompletespinalcordtransactionthroughfiguringouttheunderlyingmechanism.ETHICALAPPROVAL:ThisstudywasapprovedbytheEthicsCommitteeofKunmingMedicalUniversity,China.ThesurgicaloperationandpostoperativecareofratswereinlinewiththerulesofChineseExperimentalAnimalProtectionandEthicsCommittee,andtheguidelineoftheNationalInstitutesofHealthSubjectheadings:SpinalCordInjuries;Tropomyosin;GeneKnockoutTechniquesFunding:theSpecialProjectforAppliedBasicResearchofYunnanProvincialScienceandTechnologyDepartment-KunmingMedicalUniversityCitethisarticle:LuoSY,HuangW,WangJ,WangXY,LiJT.Effectsoftropomyosin4appliedinspinalcordinjuriesvialentiviralvectorrecombinationandtheunderlyingmechanism:studyprotocolforarandomizedcontrolledtrial.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(37):5573-5579.1实验设计Experimentaldesign1.1实验设计类型①随机对照动物实验；②基因水平的机制探索实验。1.2实验设计的描述①随机分组对照，动物体内实验；②细胞水平，基因敲除实验。1.3实验完成地点中国，昆明，昆明医科大学神经科学研究所神经干细胞培养实验室(云南省高校神经科学重点实验室)。2学术背景及理论基础Academicbackgroundandtheoreticalbasis2.1前言脊髓损伤后常因感觉和运动功能缺陷而致终生残疾，因此其修复的方法成为众多研究的焦点。目前，治疗脊髓损伤的两种关键策略包括干细胞移植和组织工程技术，前者对于改善功能是有用的，但是并非成熟的治疗方法，离真正的临床应用还有很大的距离；后者在脊髓损伤的修复策略中是很有吸引力的，然而其在临床实践中也缺乏实质性的应用[1-3]。脊髓损伤研究主要的问题是面临发生于损伤脊髓的众多复杂事件，因而很难仅仅根据一些已知的分子就确定众多相关因子中的重要分子，而蛋白组学的应用为描绘脊髓损伤后分子的变化提供了可能，依此可找到新的以系统生物学为基础的蛋白靶点。2.2背景研究原肌球蛋白(Tropomyosin，TPM)是4种基因(TPM1，TPM2，TPM3，TPM4)编码的一个蛋白质家族，与脊髓损伤的一些病理过程相关[4]。研究显示TPM4有稳定F-肌动纤维的作用，在肌肉收缩的调节中发挥重要的作用[5]。此外，TPM4作为一种仅次于其它细胞骨架肌动蛋白的一种有趣的候选蛋白，可在未成熟的神经元中调节转录[6-8]，并与肌肉相关[4-5]。TPM4的表达也在肿瘤中和神经系统被发现[9-11]，如费菲[10]发现TPM4在高低转移潜能的人类乳腺癌细胞株MDA-MB-435中表达有差异，在淋