反相色谱流动相的设计.

1反相液相色谱流动相的设计反相液相色谱法流动相的选择1.固定相对分离影响回顾2.常用的有机溶剂及其选择性3.流动相pH值的影响4.流动相和固定相的优化5.梯度洗脱程序6.柱温的影响7.应用举例8.其他关键细节概要色谱分离的终极目标：关键组分的分离4反相液相色谱流动相固定相:•键合相类型(C18vs苯基)•颗粒类型(核-壳vs整体硅胶)流动相:•溶剂的选择(乙腈vs甲醇)•流动相pH•温度•梯度固定相对分离影响回顾Kinetex核-壳技术2.6um色谱柱可以提高3倍柱效（与5um全多孔比较）提高柱效改善分离提高柱效改善分离固定相选择性对分离度的影响回顾1疏水性立体互动氢键给予氢键接受阳离子选择性键合相与样品的交互作用:9min12345mAU0255075100125150175min12345mAU020406080100C18Polar-RP1+212OHHHOHCH3HEstradiolOHHHOCH3HEstroneC18Phenyl固定相选择性对分离度的影响回顾2LC实验室，一定要有一套互补性强的色谱柱相关物质检查之系统适应性试验各种不同基材色谱柱性能比较选择正确的固相载体固定相选择性对分离度的影响回顾3min01234mAU020406080100120MWD1A,Sig=220,8Ref=off(ZA04061A\STEGEM02.D)1.8411.9022.8393.266Area:210.0583.86512345Gemini®3uC18•全多孔性载体•从分析到制备•Rs1&2=1.27•背压=264Bar•塔板数=16700min01234mAU020406080100MWD1A,Sig=220,8Ref=off(ZA04061A\STEONYX2.D)1.4971.5672.4852.956Area:209.3863.61712345Onyx™C18•整体技术载体•对生物样品接受度高•Rs1&2=1.35•背压=86Bar•塔板数=13800min01234Norm.-20020406080100120140MWD1A,Sig=220,8Ref=off(ZA04061A\STEKIN21.D)1.4141.4792.4412.8763.51412345Kinetex®C18•核-壳技术载体•提升分离度•Rs1&2=1.61•背压=340Bar•塔板数=20300固定相选择性对分离度的影响回顾4固定相选择性对分离度的影响回顾5推荐的固定相选择必备工具:1、反相色谱柱选择终极指南画报2、反相色谱柱选择终极指南画册3、反相柱筛分工具14有机溶剂的选择常用的有机溶剂流动相的选择比固定相的选择更具有挑战性，因为它的选择的没有限制的。然而，在实际的方法开发中，我们都会大大缩小选项，集中精力在那些会带给我们最大成功可能性的条件上典型的反相溶剂:弱溶剂:水/缓冲盐强溶剂:乙腈(64)甲醇(34)混合溶剂(1)THF(1)使用频率选择溶剂的考虑因素一种溶剂的强度取决于疏水性的强弱。溶剂强度会决定洗脱下来一个给定化合物所需的量。反相溶剂的强度:•水：0•甲醇2.6•乙腈3.1•THF4.4溶剂选择需要考虑的其他因素：甲醇-粘度较高，在小粒径或长柱提高流速时会受到限制乙腈-价格相对要高四氢呋喃-低波长下有紫外吸收，粘度高溶剂强度溶剂强度:乙腈Vs甲醇35%甲醇色谱柱:Gemini5µmC6-Phenyl,150x4.6mm流动相:20mM磷酸二氢钾（pH2.5）%有机溶剂如图所示流速:1.0mL/min检测波长:220nm1.糖精2.对羟基苯甲酸3.山梨酸4.脱氢乙酸5.对羟基苯甲酸甲酯20%乙腈用乙腈时分析物更早洗脱下来（即使乙腈的百分比更低）用乙腈洗脱的时候，洗脱顺序发生了变化溶剂选择性给定溶剂的洗脱强度由它的疏水性决定（如，庚烷比己烷强，因为它的疏水性更强）然而，溶剂的选择性，是由它的极性性质所决定的（如，庚烷和己烷都具有相同的溶剂选择性）乙腈有偶极矩，但是在氢键作用下又是非常弱的质子接受体NCH3四氢呋喃在氢键作用下能接受质子，但不能给予质子O甲醇在氢键作用下既是强的质子给予体又是质子接受体CH3OH用不同的溶剂优化4种类固醇的分离溶剂选择性溶剂的筛选(等度条件方法)1.从高比例乙腈开始逐步减少，直到k‘在2-10之间（如果可能）80%AcCNk’=025%AcCNk’~621%AcCNk’~1140%AcCNk’~0.8溶剂的筛选(等度条件方法)2.用其他溶剂重复操作:苯基色谱柱溶剂的选择在任何反相的方法中，选择乙腈或甲醇会对最终方法的选择性有显著的影响。然而，当用苯基固定相的时候（如Lunaphenyl-Hexyl;SynergiPolar-RP），你会发现甲醇具有更好的选择性，因为它使得苯基固定相的pi-pi作用更为明显。这很可能是因为乙腈氰基上pi电子影响了分析物上的pi电子和固定相苯环上的pi电子之间的作用，而甲醇不会有这样的影响。乙腈上的氰基会干扰固定相苯环与分析物分子之间的pi-pi作用NCH3甲醇在氢键作用下既是强的质子给予体又是质子接受体CH3OH苯基色谱柱溶剂的选择色谱柱:Luna5mC18(2)150x4.6mmLuna5mPhenyl-Hexyl150x4.6mm流动相:A:20mM磷酸二氢钾pH2.5B:27%乙腈或50%甲醇流速:1.0mL/min化合物:北美黄莲提取物1.黄莲碱2.小檗碱苯基色谱柱溶剂的选择27:73乙腈:20mM磷酸二氢钾pH2.5min12345mAU020406080100120LunaC18(2)min12345mAU020406080100120LunaPhenyl-Hexyl苯基色谱柱溶剂的选择50:50甲醇:20mM磷酸二氢钾pH2.5min510152025mAU02040608010012LunaC18(2)min510152025mAU010203040506012LunaPhenyl-Hexyl26缓冲盐和流动相pH值的作用反相色谱中缓冲盐的选择对于HPLC方法开发来说，从数量众多的缓冲盐中选择出正确的缓冲盐，非常不容易但事实不是这样,因为只需几种缓冲盐就能解决大多数问题!!估计流动相pH值时的实际考虑：1.目标物质的稳定性2.固定相在低pH值条件下水解酸性强于TFA时，就会造成固定相流失减少保留，暴露的硅醇基不同厂家/品牌的填料的稳定极限不同3.高pH值条件下硅胶溶解一般的硅胶基质固定相稳定至pH～8保护性键合（如Luna）稳定提高至pH～10有机硅胶杂化（如Gemini）稳定提高至pH～12反相色谱中缓冲盐的选择反相色谱中缓冲盐的选择低pH缓冲盐pKaRangeTFA22.5磷酸2.11.1-3.1甲酸*3.82.8-4.82.54.57.08.510中性pH缓冲盐pKaRange磷酸盐(pK2)7.26.2-8.2高pH缓冲盐pKaRange碳酸氢盐pK210.39.3-11.3pH值对固定相的影响OSiOSiOSiOHOHOHOOOSiSiSipH3.5OSiOSiOSiOOHOOOOSiSiSipH3.5任何硅胶基质的反相填料键合和端基封尾之后都会有一定的硅醇基残留。这些硅醇基在pH3.5以上都能够去质子化。去质子化的硅醇基能够与碱性的物质形成离子交换作用，造成峰形拖尾硅醇基质子化离子交换减少峰形拖尾减少硅醇基去质子化离子交换作用增加增加了峰形拖尾pH值对分析物的影响反相色谱最主要的保留机理是疏水作用。化合物离子化会使得他们具有极性化合物的行为，减少与固定相的疏水作用，降低保留能力分子的离子化状态可以由流动性的pH值决定。因此，流动性的pH值能影响具有离子化基团的分析物的保留性能•疏水性增强•更强保留•疏水性减小•更弱的保留•疏水性增强•更强保留•疏水性减小•更弱的保留pH值对分析物的影响pH值对分析物保留行为的影响H+碱化酸化水溶性流动相烷烃类键合相pH值对分析物保留行为的影响H+碱化酸化水溶性流动相烷烃类键合相H+pH值对分析物保留行为的影响BNABNAANB阿米替林(pKa9.4)=（B）碱性甲苯=(N)中性萘普生(pKa4.5)=（A）酸性pH值对分析物保留行为的影响首选：pH＜pKa－2次选：pH＞pKa＋2pH值对分析物保留行为的影响首选：pH＞pKa＋2次选：pH＜pKa－2化合物pKa的预测缓冲盐的浓度•一般采用20mM～50mM•依据样品浓度，建议为样品浓度的5倍•依据色谱柱硅羟基活度，活度越大，需要浓度越大•对碱性化合物，高浓度缓冲盐可以减弱反相色谱柱的“阳离子选择性”•梯度洗脱和在线混合时注意高浓度缓冲盐的溶解性反相色谱柱的阳离子选择性在硅胶表面的带电硅醇基可与带电碱性物质产生离子吸引作用，可造成正面或负面的影响。min00.511.522.5mAU-20020406080100120140DAD1A,Sig=210,4Ref=360,100(DJ031111\CATECHOL000065.D)min00.511.522.5mAU0255075100125150175DAD1A,Sig=210,4Ref=360,100(DJ031111\CATECHOL000066.D)肾上腺素阳离子选择性－改善极性碱的保留LunaPFP(2)Luna®C18(2)XICof+MRM(43pairs):310.200/265.200DaID:Methadone1fromSample2(XBC1850x3_Opiates_m...Max.4.0e4cps.0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5295785113140168196224252280308Time,min0.05.0e51.0e61.5e62.0e62.5e63.0e63.5e64.0e6Intensity,cpsMethadoneXICof+MRM(43pairs):337.200/105.100DaID:Fentanyl1fromSample2(XBC1850x3_Opiates_meo...Max.3.6e6cps.0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5295785113140168196224252280308Time,min0.05.0e51.0e61.5e62.0e62.5e63.0e63.5e6Intensity,cpsFentanylXICof+MRM(43pairs):310.200/265.200DaID:Methadone1fromSample3(KinPFP50x3_meoh/for...Max.1.3e4cps.1.02.03.04.05.06.07.08.057113168224280336391447Time,min0.02.0e54.0e56.0e58.0e51.0e61.2e61.4e6Intensity,cpsMethadoneMethadoneXICof+MRM(43pairs):337.200/105.100DaID:Fentanyl1fromSample3(KinPFP50x3_meoh/formic...Max.7.1e5cps.1.02.03.04.05.06.07.08.057113168224280336391447Time,min0.01.0e52.0e53.0e54.0e55.0e56.0e57.0e5Intensity,cpsFentanylFentanyl阳离子选择性－碱性物质峰形变差Kinetex®PFPKinetexXB-C18美沙酮美沙酮芬太尼芬太尼缓冲盐浓度对阳离子选择性的影响Luna5uSCX100A250×4.6mm乙腈：50mmol/l磷酸二氢钾（PH3.0）（5：95）缓冲盐浓度对阳离子选择性的影响Luna5uSCX100A250×4.6mm乙腈：100mmol/l磷酸二氢钾（PH3.0）（5：95）45流动相和固定相的优化优化流动相选择性溶剂筛选：乙腈，甲醇确定适合的缓冲盐有调节pH值来调整保留和选择性