基于主客体作用的荧光传感器的原理与应用新进展

基于主客体作用的荧光传感器的原理与应用新进展(渤海大学化学化工与食品安全学院物理化学专业李元丽2011060015)摘要:荧光传感器在各领域中的应用都非常的广泛,如分子灯塔、分子印记以及药物的分析检测等方面。本文着重介绍荧光传感器新器件-激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCFM）的原理及应用新进展。引言当今科学技术特别是电子技术的发展，大大拓展了高分子材料形态、表面和界面的研究方法，从而使高分子材料形态、表面和界面的研究由微米级进入到纳米级。如研究高分子材料表面形态的方法有X射线微聚焦荧光谱（X-raymicrofocusfluoroscopy）、可见光干涉显微镜（visible-lightdifferentialinterferencemicroscopy）和光声傅立叶红外光谱（photoacousticfouriertransforminfraredspectroscopy）[1]。但这类技术是非直接的观察技术,其精度只能达到几微米限制了它们的应用。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）是广泛应用的具有亚微米级精度的两种图象技术[2]；20世纪80年代开始逐步发展起来的原子力显微镜AFM，其精度可达到小于50nm，因此，是更理想的得到高分子材料形态、表面和界面的方法[3,4]。但这类方法却存在制样困难等问题，如有的需要采用表面刻蚀或表面染色（stain）以提高对比度,这就损伤了样品；有的需要制作成几十纳米厚的薄片，制样难度很大。X-射线光电子能谱（XPS）[5]则是一种广泛应用的表面分析方法，主要用于成分和化学状态的分析，无成象功能。激光扫描聚焦荧光显微镜LSCFM（LaserScanningConfocalFlouresenceMicroscopy）是一种刚出现不久的功能强大的图象工具，其精度介于上述几类技术之间,为亚微米级（500nm）[6]。由于LSCFM具有精度较高、制样简单、可对聚合物的三维形态进行无损快速分析的特点,因此，在生物分子、高分子薄膜、药物控释、高分子合金和复合材料等领域中逐渐得到应用，如用于表征高分子合金形貌、高分子材料的表面和界面[7～10]、药物在释放本体中的分布、核-壳（core-shell）结构高分子等。虽然目前国外有大量的有关LSCFM应用研究的报道，但在国内，由于LSCFM价格昂贵，只有个别单位拥有，其应用研究的报道还很少。本文着重介绍LSCFM工作原理及其在表征高分子材料形态、表面和界面中的应用情况。1LSCFM的工作原理及特点激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCFM）是一种采用激光作扫描光源，对含有荧光物质的样品进行逐点、逐行、逐面地快速扫描成象的方法。系统经一次调焦，扫描被限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品在不同深度层次的图象。在这种技术中，对比度是由加在系统中的少量荧光染料（Dye）提供的。某些样品在可见光中观察不到的结构细节，经过荧光染料染色处理后，以激光照射时，可因荧光作用而发射可见光，形成可见的图象[11]。LSCFM测试的灵敏度主要决定于聚焦（Confocal）、物镜（Objective）、探测器（Detector）和光源（Lightsource）四个方面。1．1聚焦图1LSCFM工作原理如图1所示，激光器被激发后产生激光，激光束通过物镜后聚焦于样品上。样品中的染料分子经过激光照射后发出荧光，发出的荧光被同一个物镜所收集并聚焦于小针孔上。样品中的聚焦点和针孔处于同一共轭面（conjugateplanes）上。聚焦点的这种光学安排被叫做“共聚焦”。于是，仅来自于聚焦点（或面）的光线才能通过针孔并被检测器探测到从而得到图象[12]。通过采用从表面逐步增加或降低距离的步进方式，可得到一系列图象（或“z-截面堆积图”），从而可对混合物的三维形态进行无损快速分析。1.2物镜数值孔径NA（numericalaperture）：NA是物镜的主要技术参数，是判断物镜性能高低的重要标志。数值孔径是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（h）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示为：NA=hsin（u/2）。通常倾向于采用最高数值孔径的物镜以使图象的亮度最大。图2LSCFM实验仪1.3探测器探测器的灵敏度越高，所需的激发强度就越低。采用高级的相(intensifiedcamera）是增加灵敏度的一个方法，但这要以增加图象的躁度为代价。1.4激光激发功率荧光图象数据的信噪比随激光激发功率的增加而增加，因此，激光的功率应该越高越好。但同时，激光激发功率应该足够低以防止在样品中发生光诱导的反应而影响得到的数据。因为光照可引起褪色并损伤细胞，所以，在研究生物等易损伤的样品时，必须注意采取一切措施来限制光照持续时间和强度。当不需要时，关闭光照，这也是共聚焦系统的内在要求。从上可知，LSCFM成象具有如下特点：（a）只有来自于聚焦面的光线才能通过针孔到达检测器并被检测器探测到;（b）只有有荧光的物质才能得到图象;（c）原位z扫描（in-situz-scan）:不需要断开样品或用显微镜薄片切片机对样品进行切片;（d）是快速而非侵蚀性的三维图象法。2激光扫描共聚焦荧光显微镜法（LSCFM）的应用LSCFM成象的应用是多方面的，并且一直在发展。例如，在高分子材料中，从仅仅观察高分子材料本体形态发展到分析其表面、界面和高分子相容性；在激素、增长素或单克隆抗体世界里，已经由相对基础的研究进入了更定量的分析等。此外，在LSCFM的管理和使用中发现,用荧光显微镜可以直接观察植物叶表皮的气孔,为荧光显微镜找到了一种新的用途。荧光显微镜的这一用途,在观察植物叶片气孔的形态、密度、开闭程度等方面,操作方法简单,既节省时间又节约经费,且观察效果好。参考文献［1］RYNTZRA,XIEQ,RAMAMURTHYAC.ThermalandimpactinducedstressfailureinpaintedTPO:Theroleofsurfacemorphology［J］.J.Coat.Technol.,1995,67（840）:35-46.［2］TRENTJS,SCHEINBEIMJI,COUCHMANPR.Rutheniumtetraoxidestainingofpolymersforelectronmicroscopy［J］.Macromolecules,1983,16（4）:589-598.［3］MIRABELLAFM,DIOHN.TheoreticalananysisandexperimentalcharacterizationoftheTPO/adhesionpromoter/paintinterfaceofpaintedthermoplasticpolyolefins［J］.PolymerEngineeringandScience2000,40（9）:2000-2006.［4］YINZ,YANGJ,COOMBSN,etal.QuantitativeprobingtheinterfacialstructureofTPO/CPOblendsbytransmissionelectronmicroscopyviaEDX［J］.Polymer,2007,48:1297-1305.［5］SCHMITZPJ,HOLUBKAJW.Investigationofthesurfaceandinterphasecompositionofadhesionpromoter/themoplasticolefinsystems:Theeffectofadhesionpromoterbaketemperature［J］.J.adhesion,1995,48（3）:137-148.［6］MAYC,FARINHAJPS,WINNIKMA.Compatibilityofchlorinatedpolyolefinwiththecomponentsofthermoplasticpolyolefin:astudybyLaserScanningConfocalFluorescenceMicroscopy［J］.Macromolecules,2004,37:6544-6552.［7］TONGJD,MOFFITM,HUANGX,etal.Useofdye-labeledethylene-butenecopolymerasatracerinlaserscanningconfocalflorescencemicroscopystudiesofthermoplasticolefins［J］.J.Polym.Sci.:PartA:PolymerChemistry,2001,39:239-252.［8］LIL,SOSNOWSKIS,KUMACHEVAE,etal.Coalescenceatthesurfaceofapolymerblendasstudiedbylaserconfocalflorescencemicroscopy［J］.Langmuir,1996,12（9）:2141-2144.［9］JONNAIH,NISHIKAWAY,KOGAT,etal.Directobservationofthree-dimensionalbicontinuousstructuredevelopedviaspinodaldecomposition［J］.Macromolecules,1995,28（13）:4782-4784.［10］YINZ,MAY,CHENW,etal.AdhesionofCPOontohighmodulusTPO:Lap-sheartestsinconjunctionwithmicroscopystudiesofthefracturesurfacestructure［J］.Polymer,2005,46:11610-11623.［11］郑学晶.烯烃聚合中负载型催化剂及初生聚合物颗粒形貌的表征评述［J］.化工进展，2007，26（12）：1695-1701.［12］RODRIGUESI,SANCHESJ.CellnucleusGFPflowanalysisfromsequencesofLSCFMimages,PortugalUT-AustinCFD2008,FirstWorkshoponComputationalEngineering:FluidDynamics［C］.Lisbon,Portugal,July10-11,2008.