基因克隆基础知识

RT-PCR逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。一、反转录酶的选择1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。3．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4．MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：商品名为Superscript和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。二、合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。二、试剂准备1．RMA提取试剂2．第一链cDNA合成试剂盒3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM4．TaqDNA聚合酶三、操作步骤1.总RNA的提取：见相关内容。2.cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTMPreamplificationSystemforFirstStrandcDNASynthesis试剂盒为例。（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA1-5μg，补充适量的DEPCH2O使总体积达11μl。在管中加10μMOligo（dT）12-181μl，轻轻混匀、离心。（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：10×PCRbuffer2μl25mMMgCl22μl10mMdNTPmix1μl0.1MDTT2μl轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。（3）加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中孵育50min。（4）于70℃加热15min以终止反应。（5）将管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。3．PCR：（1）取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2μl上游引物（10pM）2μl下游引物（10pM）2μldNTP(2mM)4μl10×PCRbuffer5μlTaq酶（2u/μl）1μl（２）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。（３）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。（４）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。（５）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。四、注意事项1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。4．PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。5．防止DNA的污染：（１）采用DNA酶处理RNA样品。（２）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。百合鳞片总RNA提取方法的比较杜运鹏李双何恒斌杨爽贾桂霞【摘要】：为了筛选出适合百合鳞片的总RNA的提取方法,本研究以东方百合品种Siberia的鳞片为材料,比较了Trizol法、改良Trizol法、RNA提取试剂盒以及改良CTAB法提取RNA的效果。结果表明:Trizol法、改良Trizol法及RNAplantplusReagent提取试剂盒均不能提取到完整的RNA;离心柱型植物总RNA提取试剂盒存在DNA污染;改良CTAB法能有效去除多糖,28S条带的荧光亮度是18S条带的1.5～2倍,D260/D280值都在1.9～2.1之间,D260/D230值大于2,两个样品的平均得率分别为103.57μg/g和119.21μg/g,说明此方法适合百合鳞片RNA的提取。RT-PCR结果扩增出了特异性条带,说明改良CTAB法从百合鳞片中提取的RNA质量高、完整性好、产率高,完全可以用于后续的分子生物学实验。灰绿藜RNA提取方法及在cDNA文库构建中的应用摘要:目的：为分离灰绿藜耐盐相关新基因，构建叶片cDNA文库，探索从盐生植物中提取高质量RNA的方法。方法：以灰绿藜叶片为材料，应用RNAPlantReagent法（Tiangen）、PlantRNApurificationReagent法（Invitrogen）、UNIQ柱式总RNA试剂盒提取法（Sangon）、SDS-LiCl法、TRIZOL试剂法（Invitrogen）等进行总RNA的提取，并构建其全长cDNA文库和抑制消减文库。结果：RNAPlantReagent法、PlantRNApurificationReagent法和UNIQ柱式总RNA试剂盒提取法获得的RNA完整性均不好；SDS-LiCl法提取的RNA完整性好（28S条带亮度是18S的2倍、条带锐利清晰）、纯度高（A250/A260为1．89±0．03，A260／A230为2．23±0．02），适合用于直接反转录及构建全长cDNA文库，并获得成功；TRIZOL试剂法简单快捷，产率高（2724±82μg／g），完整性较好，可经mRNA纯化后用于抑制消减文库的构建并获得成功。结论：建立了用于构建高质量cDNA文库的灰绿藜RNA的制备方法。CDNA构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：SepharoseCL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接详解一).构建cDNA文库：以生物细胞的总mRNA为模板，用逆转录酶合成互补的双链cDNA，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是cDNA文库。1、mRNA的提取及其完整性的确定1）总RNA的提取RNA提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA的分离高等真核生物mRNA分子的3'端均有poly(A)尾，将总RNA通过寡聚（DT）纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。3）mRNA的纯化①按照大小对总mRNA进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。4）mRNA完整性的确定确定mRNA完整性的方法有三种：①直接检测mRNA分子的大小；②测定mRNA的转译能力；③检测总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力。2、cDNA的合成和克隆1）cDNA第一链的合成用亲和层析法得到mRNA后，根据mRNA分子的3'端有poly(A)尾结构的原理，用12~20个核苷酸长的oligo（dT）与纯化的mRNA混合，oligo（dT）会与poly(A)结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条RNA-DNA的杂交链。oligo（dT）结合在mRNA的3'端，因此合成全长的cDNA需要反转录酶从mRNA分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是mRNA链很长时，为此建立了一种随机引物法合成cDNA。随机引物是一种长度为6~10个核苷酸，由4种碱基随机组成的DNA片段。与oligo（dT）仅与mRNA3'端结合不同，它们可以在mRNA的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是RNA-DNA的杂交体。把cDNA克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的RNA转变成DNA链，即形成双链DNA分子。2）.双链cDNA的合成合成cDNA第二条链有两种方法。一种方法是利用cDNA第一链的3'末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成cDNA第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链cDNA在一端有一个发夹环，可以用单链特异的S1核酸酶切去。但是S1核酸酶的处理，常常会“修剪”过多的cDNA顺序，使cDNA丢失了mRNA5'端的部分顺序。另一种方法是用大肠杆菌的RNaseH进行修饰。RNaseH能识别RNA-DNA杂交分子并把其中的RNA切割成短的片段，这些RNA短片段仍与cDNA第一链结合，可被新合成的DNA所取代。新合成的DNA存在切口，用DNA连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的DNA链。RNaseH法优于S1核酸酶法，它能获得包括mRNA5'端全部或绝大部分的更长顺序cDNA分子。3）将cDNA重组到载体上合成的cDNA与载体DNA进行连接一般有3种方法：①借助于末端转移酶的3'-OH端合成均聚物的能力，双链cDNA和线性化载体DNA的3'-OH端分别加上均聚核苷酸链；②双链cDNA和线性化载体DNA分别用Klenow片段进行末端补平，然后用T4DNA连接酶进行齐头连接，形成重组体；③通过粘性末端连接。4）.转化重组的载体DNA分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的DNA含有不同的cDNA基因时，整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这样的转化子群体构成该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。5）.目的cDNA克隆的鉴定用于从cDNA文库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有3种：①核酸杂交②免疫学杂交检测③cDNA同胞选择近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术（rapidamplificationofcDNAends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。经典的RACE技术是由Frohman等（198