基因治疗的现状及策略

1北京师范大学珠海分校《分子生物学与基因工程》综述题目：基因治疗的现状及策略姓名杨意意学号1118010133院系工程技术专业生物技术年级11生物3班指导教师李志鹏2013年6月8日2基因治疗的现状及策略摘要随着科技的进步，基因工程得到了很大的发展，而基因治疗也越来越受到人们的关注。基因治疗的研究历史已有很长一段时间，但是以目前的技术，还有一些问题尚需解决。本文通过查阅资料，对基因治疗目前的现状进行阐述和总结，并分析了一些主要面对的问题和解决问题的策略。关键词：基因治疗；载体；靶细胞AbstractWithadvancesintechnology,geneticengineeringhasbeenagreatdevelopment,andgenetherapyarealsomoreandmorepeople'sattention.Genetherapystudyofhistoryhasbeenaverylongtime,butwithcurrenttechnology,therearesomeproblemstobesolved.Inthispaper,accesstoinformation,thecurrentstatusofgenetherapyelaborateandsummarize,andanalyzesomeofthemajorproblemsencounteredandproblem-solvingstrategies.Keywords：Genetherapy；Vector；Targetcell31.基因治疗的概述基因治疗技术目前还是一个较为年轻的技术，是生物学和医学相结合的一个新的研究领域。是基因工程的一种新方向。1.1基因治疗的定义基因治疗是指通过基因水平的技术操作向靶细胞插入正常功能的基因或有治疗作用的DNA序列，纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗的目的。是一种基因水平的生物医学高技术[1]。1.2基因治疗的步骤及方法1.2.1基因治疗的步骤（1）特异性外源基因的获得即保持基因结构的完整性，利用分子生物学手段分离与克隆目标基因，如酶切法，逆转录法等[2]。（2）靶细胞的分离与体外培养靶细胞是指接受外源基因的细胞，来源于被治疗对象。基因治疗实施过程中从被治疗对象体内提取合适的靶细胞进行体外培养、增殖，以获得足够的靶细胞来接受外源基因。（3）目的基因的导入选取适当的基因转移方法，经外源基因转移到受体细胞核内，使其在染色体上整合或称为不整合的游离基因。（4）目的基因的表达与调控目的基因的表达是基因治疗的关键之一。为此，可运用连锁基因扩增等方法适当提高外源基因在细胞中的拷贝数。在重组病毒上连接启动子或增强子等基因4表达的控制信号，使整合在宿主基因组中的新基因高效表达，产生所需的某种蛋白质[3]。1.2.2基因治疗的方法基因治疗常用方法有2种,即体内疗法和体外疗法,而主要的方法是体外基因治疗,即在体外用基因转染病人靶细胞,然后将经转染的靶细胞输入病人体内,最终给予病人的疗效物质是基因修饰的细胞,而不是基因药物。体内疗法是将外源基因导人受体体内有关的器官组织和细胞内,以达到治疗的目的。这些基因药物可以是完整基因,也可以是基因片段(包括DNA或RNA);可以是替代治疗,也可以是抑制性治疗(包括DNA转录水平和mRNA翻译水平)。基因药物不但可用于治疗疾病,而且可用于预防疾病。这类基因药物疗法简单易行,发展迅速,新型基因药物也不断产生。1.2.3基因治疗分类（1）基因修正导入的外源基因通过同源重组，特异性原位修复基因缺陷，这种情况下受体内的基因组不发生改变。（2）基因置换指用正常的基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。（3）基因增补把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去。（4）基因失活将特定的反义核酸(反义RNA、反义DNA)和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。（5）“自杀基因”在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因”。5（6）免疫基因治疗免疫基因治疗是把产生抗病毒或肿瘤免疫力的对应与抗原决定族基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如细胞因子(cytokine)基因的导入和表达等[4][5]。（7）耐药基因治疗耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。如向骨髓干细胞导入多药抗性基因中的mdr-1。2.基因治疗现状目前，基因治疗已从早期的单基因遗传并的治疗扩展到对人类健康更具威胁的多基因遗传疾病，包括遗传病，恶性肿瘤，心血管疾病，代谢性疾病及感染性疾病等。2.1单基因遗传性疾病至今,已有18种单基因遗传病开展了基因治疗临床试验。主要为肺囊性纤维化、戈歇病、血友病、a-抗胰酶缺失和严重联合免疫缺陷症等。单基因遗传病基因治疗的关键是外源基因能在体内长期稳定的表达。因此,选择合适的转移载体以及合适的靶细胞十分关键。腺病毒具有强的免疫原性,且其介导的外源基因不能整合,可能难以达到长期稳定表达的要求。虽然Marina等成功地运用了逆转录病毒载体,但由于其滴度及转导效率较低只适于体外转导,因而需要进一步改进[6]。研究人员认为,免疫原性低、可感染多种分裂相和非分裂相细胞、能够整合且适于体内转导的腺相关病毒和慢病毒,可能是治疗单基因遗传病的理想载体。2.2恶性肿瘤在恶性肿瘤的基因治疗中,有较多种方法,最常用的是免疫基因治疗,其次是自杀基因和肿瘤抑制基因治疗。由于肿瘤细胞本身存在逃避免疫系统识别和攻击的机制,因此,仅靠自身免疫系统对肿瘤的直接杀伤是有限的。而自杀基因通6过将前药转变为对细胞有毒害的药物造成对肿瘤细胞的直接杀伤,并有一定的旁杀效应,从而降低肿瘤的负荷。研究结果表明,无扩展中位生存期和总中位生存期,且与对照组差异无显著性。原因主要是逆转录病毒载体体内转导效率太低,另外前药如何能顺利透过血脑屏障也是需要解决的问题[7]。但患者大多数能够耐受,且无明显不良反应。在肿瘤抑制基因治疗中用的最多的是p53基因。目前已有一种用腺病毒载体介导p53基因治疗头颈鳞癌的方案进入Ó临床试验阶段。除以上3种方法外,进入临床试验的方法还有反义、化疗保护、单链抗体、癌基因下调以及载体介导的肿瘤细胞裂解等。进一步提高基因的体内转导效率是提高肿瘤基因治疗效果的关键。由于肿瘤是复杂的多基因疾病,仅依靠某一种基因治疗方法似难于奏效,多种方法进行有效联合,可产生优势互补,并可能产生抗肿瘤的协同效应。另外,在当前一段时间内,基因治疗可能还应与常规的治疗手段,如放疗、化疗及手术进行联合,以取得更为明显的效果,发挥出基因治疗的优势,体现其临床上的应用价值。2.3心血管疾病在临床试验中,通过转移内皮细胞生长因子及成纤维细胞生长因子基因的治疗,已实现在下肢和心肌缺血中促进了血管的生成和血液的流通。另外,在冠状动脉狭窄及血管移植后再狭窄的动物模型中,通过转移VEGF、一氧化氮合酶、TK、Rb、金属蛋白酶组织因子、FasL等应用,均取得了有前景的效果。2.4感染性疾病目前感染性疾病的基因治疗主要是集中在治疗艾滋病。利用DNA疫苗防治艾滋病毒的感染已进入试验阶段。已有近400例艾滋病患者接受临床试验,结果表明是安全可行的,若能更高效地转导和回输更多的靶细胞,治疗效果将会更为明显。73.基因治疗存在的问题及策略3.1基因治疗面对的问题3.1.1用于治疗的基因过少目前在已用于临床实验的治疗基因仅集中于少数基因,对大多数疾病致病基因有待阐明。这不仅限于致病基因的发现,同时也包括已知和目前未知功能基因的表达调控序列的确定,以及其相互作用规律的阐明,这将有赖于人基因组计划、尤其是功能基因组学的发展。3.1.2基因导入系统缺乏靶向性，效率较低在以腺病毒为载体的p53基因转移治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病毒注射到肿瘤局部。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织的很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用。即使第一例逆转录病毒介导ADA基因转移成功治疗SCID的病例，也因为导入效率较低，前后经历了11次体外转导和回输。目前基因治疗没有获得满意的结果,目的基因在体内不能持续表达和表达水平不高是其重要的影响因素之一。3.1.3导入的基因表达缺乏可控性理想的基因治疗应能根据病变的性质和严重程度不同，调控治疗基因在适当的组织器官内和以适当的水平或方式表达。但目前还达不到这一目标，其主要原因是：现有的基因导入载体容量有限，不能包容全基因或完整的调控顺序，同时人们对导入的基因在体内的转录调控机理的认识有限。这说明了基因表达的可控性不高，要使外源基因能按需表达,最理想的方法是使导入的外源基因在人体特异组织和细胞中进行长期有效的表达,并能受生理信号的调控。但是在目前,载体将外源目的基因导入宿主细胞后,目的基因并不一定完全按照需要适时、适量和适度地进行表达。目前,载体的调控能力较差,也是影响基因治疗效果的一个重要因素[8]。83.1.4安全性问题这是目前基因治疗争论最为激烈的问题,比较典型的是1999年美国一位18岁的患鸟氨酸转甲酰酶缺乏症的病人死于基因治疗,主要是由于基因治疗对象选择有误及用药剂量过大;尽管RV载体进入细胞后是随机整合至宿主细胞染色体的,但其仍具有潜在的插入突变可能性。外源目的基因导入宿主细胞后,会整合至细胞基因组中,整合位点对于其引起的结果起决定性作用。但是大部分载体的插入位点都是随机的,这样就有可能插入到某个癌基因附近引发肿瘤。法国几名儿童因采用RV载体进行治疗而患上白血病,再次引起人们对基因治疗安全性产生怀疑。外源基因产物对宿主的危害性,当患者体内引入外源基因后,表达出大量原来缺乏的蛋白质,这可能为引起严重免疫反应,甚至导致有害的自身免疫,这一点也是值得引起重视的。另外，病毒性载体通常是将其基因组中的一部分基因置换为外源目的基因,转染宿主细胞。反转录病毒还需要包装细胞的辅助作用。病毒之间的遗传物质会发生基因重组或重配,而产生具有复制能力的野生型重组病毒,使机体感染或出现细胞毒性，从而产生具有复制能力的野生型重组病毒。因此，在方法或材料不当的情况下，基因治疗可能具有潜在的、长期的、延迟的副作用[9]。3.2基因治疗发展策略3.2.1选择理想的载体一个理想载体需要有高效的转移率,能将外源基因定向导入靶细胞,能转导不分裂的细胞,能稳定整合到宿主染色体上。自1995年以来，全世界基因治疗领域的科学家们在改善基因导入系统和载体方面作了大量的努力，新思路、新技术和新方法层出不穷。目前，在基因导入载体方面出现了两大主流：一是非病毒载体系统；二是病毒载体系统。病毒性载体因其来源于病毒而转染效率较高。但是,近年来随着用病毒性载体进行临床试验的一系列不安全问题的出现,促使人们致力于研发大量非病毒性载体。而这类载体虽然具有制备简单、可插入外源基因片段的大小不受限制、安全性好等突出的优点,但他们与传统的病毒性载体相比,最明显的劣势即是其转染低效性[10]。纳米医学技术的产生和发展为提高9非病毒性载体的转染率带来了新的曙光。加强对非病毒载体和人工载体的研究将成为基因治疗的重要策略。3.2.2目的基因的高效表达基因的高效表达是一个非常复杂的问题,它受DNA拷贝数、转录有效性、mRNA的加工转移和稳定性、翻译有效性,以及蛋白质加工、分泌及稳定性等因素的影响,而且不同基因高效表达的限速因素又不一致。因此,提高目的基因表达的手段不仅限于表达载体调节成分的设计,人工改造基因使之协调于调节顺序及宿主细胞也是一个重要的趋势。虽然目前治疗基因表达调控的研究和进展相对滞后，主要受制于载体的包装容量。随着人类基因组计划的进展与完成，新的基因座控制区、隔离子、内含子、特异的启动子、增强子等的发现与分离，必定带动基因治疗向前发展。4.基因治疗的前景展望高效表达载体和适用于临床