基因治疗的策略

基因治疗的策略？答：1、基因置换或称基因矫正：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。2.基因添加：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。3.基因干预：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。4.自^杀基因治疗：将“自^杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自^杀”效应。PCR的基本原理？答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94℃。退火：引物＋单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70℃左右，TaqDNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。本章的主要内容：基因表达调控的基本概念、特点、基本原理。乳糖操纵子的结构、负性调控、正性调控、协调调节、转录衰减、SOS反应。真核基因及基因表达调控的特点、顺式作用元件和反式作用因子的概念、种类和特点.以及它们在转录激活中的作用。本章的要点：第一节基因表达调控基本概念与原理一、基因表达的概念基因是一段DNA分子，编码一种多肽链或RNA。基因通过转录和翻译产生具有一定功能的蛋白质的过程。大多数基因的表达产物是蛋白质，部分基因如rRNA和tRNA基因的表达产物是RNA.二、基因表达的特点（A）时间特异性或发育阶段特异性、（B）空间特异性或组织细胞特异性，（C）有两种表达方式，管家基因几乎在所有的细胞和所有的发育阶段持续表达，基本不受环境因素的影响，只受启动子调节。另外一些基因的表达受环境因素的诱导或阻遏。（D）基因表达可在多层次上受到调节如基因、转录、转录后加工翻译和翻译后加工等水平上进行调节。但最主要的是转录水平的调节，本章讨论的内容是原核基因和真核基因转录水平的调节。三、基因转录激活的基本要素（A）特异的ＤＮＡ调节序列是调节基因转录的ＤＮＡ片段,如原核生物操纵子调控区中的启动序列、操纵序列、ＣＡP蛋白结合位点和真核基因的启动子、增强子和沉默子等。（B）调节蛋白是调节基因转录的蛋白因子，如原核生物的阻遏蛋白和ＣＡｐ蛋白、真核生物的基本转录因子和特异转录因子等。（C）ＲＮＡ聚合酶是催化基因转录最主要的酶。原核生物只有一种ＲＮＡ聚合酶，催化所有ＲＮＡ的转录。真核生物有三种ＲＮＡ聚合酶，催化不同ＲＮＡ的转录。ＤＮＡ调节元件和调节蛋白可以通过影响RNA聚合酶的活性来调接基因转录激活。第二节原核基因转录调控一原核基因表达调节的特点：（A）σ因子决定ＲＮＡ聚合酶识别特异性，帮助ＲＮＡ聚合酶识别不同启动子，对不同基因进行转录。（B）转录调节普遍采用操纵子模式,原核生物功能相关的基因往往串联地排列在一起，在一个共同的调控区的调节下，一起转录生成一个多顺反子，最终表达产物是一些功能相关的酶或蛋白质，它们－起参与某种底物的代谢或某种产物的合成。（C）阻遏蛋白对转录的抑制作用是普遍存在的贡性调节。二、乳糖操纵子的结构、负性和正性调节及协调调节（A）乳糖操纵子包括三个结构基因（Z、Y、A）三个调节序列：启动序列、操纵序列和CAP蛋白结合位点，以及一个调节基因，调节基因编码阻遏蛋白。（B）、阻遏蛋白的负性调节蛋白质与DNA结合抑制基因的转录属于负性调节。操纵序列是控制操纵子中结构基因转录的开关,阻遏蛋白与操纵序列结合可阻止RNA聚合酶对结构基因的转录。当乳糖存在时，乳糖的分鲜产物半乳糖与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白与操纵序列解离，诱导基因的转录。（C）CAP的正性调节蛋白质与DNA结合增强基因转录属于正性调节。在启动子上游子存在CAP结合位点,CAP与其结合后可促进RNA聚合酶与启动秀列结合，从而促进转录。但是,CAP单独不能与其位点结合，只有与cAMP形成复合物后才能与CAP位点结合。细胞内葡萄糖缺乏时，cAMP水平升高，cAMP一CAP复合物形成并与CAP结合位点结合，促进RNA聚合酶与启动序列结合并启动转录。葡萄糖丰富时，cAMP水平降低，cAMP一CAＭP复合物不能形成，ＣＡP不能与DNA结合，不能启动转录。（D）、协调调节即阻遏蛋白的负性调节与ＣＡＰ蛋白正性调节的协同作用。当阻遏蛋白与操纵序列结合封闭转录后，ＣＡＰ不能启动转录，但是阻遏蛋白脱离操纵序列而解除封闭后，如果没有ＣＡｐ的作用也不能启动转录，所以乳糖操子的诱导作用即需要乳糖的存在又需要葡萄糖的缺乏。三、操纵子的其他转录调节机制（A）转录衰减作用最早在阻遏型的色氨酸操纵子发现，当色氨酸丰富时，核蛋白体迅速通过前导编码序列！使后面的序列形成衰减子，导致ＲＮＡ聚合酶的脱落和转录终止。转录衰减实质上是转录和前导肽翻译过程的偶联，，是原核生物特有的转录调节机制。（B）Ｓ0Ｓ反应是大肠杆菌特有的一种ＤＮＡ损伤修复机制.参与ＤＮＡ损伤修复的一些Ｓ0Ｓ基因受一个共同的LｅｘＡ阻遏蛋白的控制，正常情况下LｅｘＡ与ＤＮＡ结合阻止了这些基因的表达，当紫外线照射造成ＤＮＡ损伤时，Ｒｅｃ蛋白产生蛋白水解酶活性，使LｅｘＡ蛋白水解失活，导致Ｓ0Ｓ基因转录表达，并对损伤的ＤＮＡ进行修复第三节真核基因转录调节真核基因数量多，基因表达调节机制复杂，基因表达可在ＤＮＡ、染色质、转录、转录后加工、翻译和翻译后加工等水平上调节，但最主要的是转录水平的调节。－、真核基因组结构特点（A）真核基因组结构庞大，由30亿碱基对组成，有4万多个基因。（B）单顺反子真核细胞一般以一个基因为转录单位，转录产物是单顺反子、即编码一种多肽的ｍＲＮＡ。（C）重复序列真核基因组中编码序列只占5一10%，其余80－90%是非编码序列，其中有大量的重复序列。重复序列长短不同,重复率不等，而且具有种属特异性。（D）基因不连续性真核基因的编码序列不连续排列，被一些非编码序列间隔开，编码序列称外显子，非编码序列称内含子。二、真核基因表达调节特点（A）RNA聚合酶原核生物只有一种RNA聚合酶，真核生物有三种，分别转录不同的RNA，RNA聚合酶II负责转录蛋白质的基因，因此该酶最为重要。（B）活性染色质结构的变化基因转录可在染色质水平上调节，基因转录激活的染色质在结构和性质上发生如下变化；（1）由于转录激活区组蛋白部分脱落，产生DNaseI超敏位点。（2）DNA拓扑构像发生变化，DNA转录时，RNA聚合酶的前面是正超螺旋，后面是负螺旋。（3）DNA碱基修饰变化转录激活的基因处于低甲基化状态。（4）组蛋白的数量、结构和化学修饰发生变化（C）正性调节占主导地位蛋白质与DNA结合抑制转录是负性调节，蛋白质与DNA结合后促进基因转录是正性调节。在原核生物中阻遏蛋白与DNA结合抑制转录是负性调节。在真核生物中有许多转录激活因子，它们与增强子DNA结合促进转录属于正性调节。三、真核基因转录激活调节真核基因转录激活也需要DNA调节序列调节蛋白和RNA聚合酶三大要素。（A）顺式作用元件真核生物的DNA调控元件称为顺式作用元件，包括启动子，增强子和沉默子。它们通过DNA和蛋白质、蛋白质和蛋白质的相互作用，最终改变RNA聚合酶的活性而调节转录。典型的启动子由TATA盒及其上游的GC盒和CAAT盒组成。增强子是远离启动子的、可促进转录的调控元件，其作用与方向和位置无关，而且具有组织特异性。它一般与转录激活因子结合，通过作用于转录起始复合物增强RNA聚合酶的活性，从而促进转录。沉默子是一种负性调控元件，它与转录抑制因子结合抑制转录。（B）反式作用因子是影响基因转录的调节蛋白，包括基本转录因子和特异转录因子，基本转录因子与RNA聚合酶构成转录起始复合物，有人将它们称为RNA聚合酶的亚基，它们在所有的细胞中都存在，对于三种RNA聚合酶，除个别基本转录因子都是通用的。特异转录录因子包括转录激活因子和转录抑制因子，前者与增强子结合增强基因转录，后者与沉默子结合抑制基因转录。转录因子一般含有DNA结合域和转录激活域，前者是转录因子与DNA结合的位点，如锌指结构和碱性氨基酸组成的螺旋.后者是转录因子与转录起始复合物中某种蛋白质相互作用的位点，此外，某些转录因子还有蛋白质和蛋白质相互的结构域（三）mRNA基因转录激活及其调节mRNA基因是蛋白质基因，在基因组中占据绝大多数，由RNA聚合酶II转录，真核RNA聚合酶II与十几种基本转录因子结合成转录起始复合物，对蛋白质基因进行转录。基本转录因子中只有TFIID可以和TATA盒结合.TFIID由TBP（TATA结合蛋白）和十几种TBP相关因子（TAF）构成。真核基因调节的三大要素是顺式作用元件反式作用因子和RNA聚合酶，它们通过DNA和蛋白质及蛋白质和蛋白质的相互作用调节的转录。例如一种转录激活因子和某种增强子结合，通过作用于转录起始复合物中的某种蛋白质引起RNA聚合酶的构想改变或化学修饰，最终导致其活性增加，从而激活转录。虽然增强子距离启动子和RNA聚合酶很远，但是DNA可以弯曲，使转录激活因子与启动子上的转录起始复合物靠近，与复合物中的某种蛋白质（TBP或TAF）相互作用，然后通过它作用于RNA聚合酶，从而激活转录。基因表达调控考点：基因表达调控的基本概念、特点、基本原理；原核生物乳糖操纵子的结构、负性调控、正性调控、协调调节、转录衰减、SOS反应；真核生物基因表达调控的特点、顺式作用元件和反式作用因子的概念、种类和特点，以及它们在转录激活中的作用。重点：基因表达调控的基本概念，原核、真核生物基因表达调控的特点，顺式作用元件和反式作用因子。难点：原核、真核生物基因表达调控的特点及机制。一、概述（一）基因表达的概念一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因，称为基因组。基因表达就是基因转录及翻译的过程。在一定调节机制控制下，大多数基因经历基因激活、转录及翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子，但并非所有基因表达过程都产生蛋白质，tRNA、rRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达。（二）基因表达的时间性及空间性基因表达的时间、空间特异性由特异基因的启动子（序列）和（或）性强子与调节蛋白相互作用决定。1时间特异性按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，这是基因表达的时间特异性。多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性。2空间特异性在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，这就是基因表达的空间特异性。又称细胞特异性或组织特异性。（三）基因表达的方式1组成性表达某些基因产物对生命全过程是必需的或必不可少的。这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因。管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。这类基因表达视为基本的或组成性基因表达。2诱导和阻遏表达与管家基因不同，另有一些基因表达极易受环境变化影响。在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因是可诱导的，称为诱导。相反，如果基因对环境信号应答时被抑制，基因表达产物水平降低的，称为阻遏。诱导和阻遏是同一事物的两种表现形式，在生物界普遍存在，也是生物体适应环境的基本途径。在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为