周念波-酿造学实验电子教案

1《酿造学实验》教案教案首页教授时间2013-2014-01学期教案编写时间2013年9月课程名称酿造学实验课程代码总学时：32实验：8学时实习：周学分0.5课程性质必修课（）选修课（√）理论课（）实验课（√）任课教师周念波职称讲师授课对象生物科技系10生物技术专业教材和主要参考资料参考资料：[1]发酵工程教研室编.酿造学实验.校内讲义,2013.[2]李阜棣,俞子牛,何绍江.农业微生物实验技术.北京:中国农业出版社,1996.[3]W.F.Harrigan.食品微生物实验手册.北京:中国轻工业出版社,2004.[4]黄方一,叶斌.发酵工程.武汉:华中师范大学出版社,2006.[5]吴根福.发酵工程实验指导.北京:高等教育出版社,2006.[6]汪穗福.微生物检验验证技术.北京:中国医药科技出版社,2006.[7]葛向阳,田焕章,梁运祥.酿造学.北京:高等教育出版社,2005.[8]邱立友.发酵工程设备.北京:中国农业出版社,2007.[9]邱立友.发酵工程设备实验.北京:中国农业出版社,2008.[10]陈长华.发酵工程实验.北京:高等教育出版社,2009.参考国家级精品课程网站：[1]（武汉大学，微生物学）[2]（华中农业大学，微生物学）[3]（浙江大学，微生物学）[4]=14538（上海大学，生物工艺学）[5]（华中科技大学，发酵工程）[6]（华东理工大学，发酵工程）教学目的和教学要求学生在学过生物化学、微生物学、工程制图、物理化学和化工原理等课程的基础上，学生通过本实验课程的学习，了解和理解微生物发酵技术的基本原理和操作方法，掌握酿造用菌种分离、选育、诱变等初筛和复筛技术，熟练操作无菌接种技术，增强学生发现问题、分析问题和解决问题的能力，培养学生扎实的实验技能基本功，懂得如何应用这些基本理论去分析和解决生产过程中的具体问题，改造原有生产过程使其更符合客观规律，实现发酵过程的优化，提高生产效率，创造更大的经济效益和社会效益。本课程以实验操作与设计为主，课堂中采用提问，设问等方式，引导学生加强对实验项目背景、实验原理的理解，并在实验过程中合理安排分组，分工，加强指导和训练，严格要求学生完成高质量的实验报告。2教学重点和难点重点：以生物化学实验和微生物学实验为主要的基础，理解酿造工业无菌技术及微生物培养的原理，熟悉掌握酿造工业无菌技术，掌握酿造产品工艺控制的关键点。难点：酿造工业无菌技术；酿造过程中参数控制及工艺设计。教学进程课次实验项目学时实验性质备注1酱油曲霉斜面活化酱油曲霉三角瓶固态培养4综合性实验实验操作2酱油种曲质量检验——测曲霉孢子数4综合性实验实验操作3实验项目实验一酱油曲霉斜面活化及米曲霉三角瓶固态培养4学时）实验性质综合性实验教学目的和要求1.学习制备综合马铃薯葡萄糖培养基的方法以及斜面接种技术。2.掌握常见菌种斜面活化方法。3.掌握固态培养技术的基本原理。4.学习产蛋白酶米曲霉固态三角瓶培养的具体方法。教学重点与难点重点：学习制备马铃薯葡萄糖培养基的方法以及斜面接种技术学习产蛋白酶米曲霉固态三角瓶培养的具体方法难点：掌握常见菌种斜面活化方法固态培养技术的基本原理实验仪器与试剂1.菌种：米曲霉菌株，由前实验得到。2.三角瓶培养基：麸皮80g，面粉20g，水80~85mL，250mL三角瓶湿料20g，0.1MPa灭菌30min。3.仪器：灭菌锅，真菌培养箱、天平、500ml刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18ml×180ml试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。教学进程（一）酱油曲霉斜面活化实验原理讲解实验步骤：1.综合马铃薯培养基的制备（1）称量去皮新鲜马铃薯20g切成1cm见方小块，放入烧杯中，加100mL~150mL自来水，置电炉上煮沸20min后，用双层纱布过滤，取滤液备用。（2）加入称好的2g琼脂，加热搅拌至琼脂完全熔化，再加入称好的2g葡萄糖、0.3gKH2PO4、0.15gMgSO4·7H2O、0.8mg硫胺素等成分，补水至100mL，并调pH至6.0。趁热分装于18ml×180ml试管，斜面以8mL~10mL为宜（摆出来的斜面不超过试管的1/2）。（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管（7支一扎）捆扎好，121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。2.分离纯化菌株转接斜面（斜面接种）接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。（1）将米曲霉的保藏斜面至常温下或30℃左右的培养箱中4~6h。（2）左手拿平板，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。（3）左手将平板放下，拿起斜面培养基。在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。（4）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。（5）斜面置于28～30℃恒温箱中，培养5～7d观察结果。本实验旨在培养学生扎实过硬的斜面活化操作技术。通过细节的讲解和示范，熟练掌握综合马铃薯培养基的制备方法和斜面接种技术，以及种曲制备内容的理解。培养学生对固态发酵的认识和理解。让学生熟知固态发酵技术的关键控制点。示范操作4（二）米曲霉三角瓶固态培养实验原理：种曲制备流程：菌种→斜面试管培养→三角瓶培养→种曲（扩大培养）。三角瓶固态培养技术小规模制得种曲的种子，供种曲生产接种所用。培养基物料比例，无机盐的含量，料水比，培养时间等因素对制备三角瓶种子有较大影响。实验步骤：1.先将称好的麸皮和面粉充分混匀，加入适量水（计量体积），拌合均匀。2.分装250mL的三角瓶中，每瓶装料20g（厚度为1~2cm），八层纱布或棉塞封口，121℃，灭菌30min。3.灭菌后趁热摇散，冷却后接入1环活化后的米曲霉试管斜面菌种，置28～30℃恒温培养72h，期间摇瓶2次，扣瓶1次。4.待菌丝生长旺盛、孢子丛生即可取出放入冰箱中，作为曲种备用。实验现象描述思考题思考题1.简述米曲霉纯种培养操作过程中的关键无菌操作技术。2.描述米曲霉斜面菌落生长特征。3.观察并描述每天米曲霉生长情况和曲料颜色变化。4.如何评价三角瓶培养物的感官指标和理化指标？课后总结分析5实验项目实验二曲种质量检验——血球计数板测定孢子数（4学时）实验性质综合性实验教学目的和要求学会孢子悬液的制备方法。掌握应用血球计数板测定孢子数方法。教学重点与难点重点：血球计数板制板及计数规则难点：计算公式的推导实验仪器与试剂1.生产菌株：米曲霉三角瓶孢子种（由上实验获得）。2.试剂：95%酒精、稀硫酸（1:10）、无菌水。3.仪器：显微镜、血球计数仪、载玻片、盖片、旋转式摇床、250mL和500mL锥形瓶等。教学进程实验原理：种曲质量要求之一是含有足够的孢子数量，孢子旺盛、活力强、发芽率高，所以孢子数及其发芽率的测定是种曲质量控制的重要手段。种曲质量标准如下：指标二级指标指标要求感官指标外观菌丝整齐健壮、孢子旺盛、米曲霉呈新鲜黄绿色，黑曲霉呈新鲜黑褐色。无夹心，无杂菌、无异色。香气具有种曲固有的曲香、无霉味、酸味、氨味等不良的气味。手感用手指触及种曲，松软而光滑，孢子飞扬。理化指标孢子数60亿/g（以干基计）以上发芽率90％以上细菌数不超过107个/g（三角瓶孢子细菌数不得检出）目前测定微生物数量方法均采用传统的稀释平板法，此方法测定细菌、酵母菌等单细胞菌类完全适宜，在重现性和准确性上均可达到精度要求。对于酿造工业测定曲霉菌等真菌孢子来讲，可以采用传统稀释平板法和血球计数板直接计数等方法测定。实验步骤：流程：曲种→称量→稀释→过滤→定容→制计数板→观察计数→计算（1）精确称取三角瓶种曲1g（称准至0.001g），倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶内，加入95%酒精5mL、无菌水20mL、稀硫酸（1:10）10mL，在摇床上充分振摇（20~30min），使种曲孢子分散，然后用三层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，使滤渣不含孢子，最后稀释至500mL。（2）制计数板取洁净干燥（如何清洁？）的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀释液1小滴滴于盖玻片的边缘处（不宜过多），让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止3~5min，待孢子沉降。（3）观察计数用低倍镜头和高倍镜头观察，由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微调螺旋，本实验通过血球计数板的使用，掌握血球计数板计数技术。并通过显微镜观察孢子形态特征及特点。熟练掌握孢子悬液制备技术和血球计数板制板技术。6才能不使之遗漏。注意：（1）如孢子位于格的线上，数上线不数下线，数左线不数右线。（2）样品稀释至每个小格所含孢子数在10个以内较适宜，过多不易计数，应进行稀释调整。使用16×25规格的计数板时，只计板上四个角上的4个中格（即100个小格）。如果使用25×16规格的计数板时，除计四个角上的4个中格外，还需要计中央一个中格的数目（即80个小格，如上图）。每个样品重复观察计数不少于2次，然后取其平均值。25×16的计数板孢子数计算方法如下：孢子数（个/g）=（N/80）×400×10000×（V/G）=5×104×（NV/G）式中：N——80小格内孢子总数（个）；V——孢子稀释液体积（ml）；G——样品重量（g）。思考题1.用血球计数板孢子计数有何优缺点？2.本方法测定的孢子数和用平板计数法测定的孢子数有何区别。课后总结分析