医学统计学第2版第四章抗体制药.

第四章抗体制药2020/1/41掌握：单克隆抗体的制备原理、方法及基本过程；单克隆抗体药物靶标的选择；基因工程抗体的类型。熟悉：噬菌体抗体库技术的原理和基本过程；单链抗体、双特异抗体的制备方法；转基因动物表达抗体的方法。了解：抗体药物的发展趋势。学习要求:第一节概述第二节单克隆抗体及其制备第三节基因工程抗体及其制备第四节噬菌体抗体库技术第五节转基因动物表达抗体第六节抗体治疗药物2020/1/43内容第一节概述一、基本概念抗体（antibody，Ab）：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白IgAb化学结构上的概念生物学功能上的概念2020/1/44抗体工程制药：利用基因工程、细胞工程和转基因动植物技术生产抗体药物的过程。2020/1/45免疫球蛋白（抗体）的基本结构1、重链和轻链重链可分为α、δ、ε、γ、μ链；轻链可分为κ、λ型。抗体的类型由重链类型决定，上述重链分别对应了IgAIgDIgEIgGIgM2、可变区和恒定区重链和轻链N端第一个结构域为可变区（variableregion,V区)，轻链其余的1个及重链的3-4个结构域为恒定区；V区存在3个高变区也称互补决定区(complementarity-determiningregion,CDR1~3)及4个骨架区（frameworkregion,FR1~4).三个高变区共同组成Ig的抗原识别部位，形成与抗原决定基互补的表位。2020/1/472020/1/48多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，对其产生的抗体也是多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。单克隆抗体：针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的、高度特异、均一、来源稳定、可大量生产的抗体。多抗与单抗传统抗血清抗原免疫所有抗体混合1234BALB/c12341234脾脏淋巴結B細胞多克隆抗体制备过程1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗体分开单克隆抗体制备过程疾病的诊断和治疗：诊断:检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断。临床治疗：如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，对器官移植排斥反应有显著抑制作用，用作免疫抑制剂。作为载体制备导向药物（Antibodydrugconjugates,ADC）治疗肿瘤。2020/1/411抗体的应用需解决的问题：鼠源性单克隆抗体的免疫原性（HAMA）；完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度；延长半衰期。其他2020/1/412基本消除了单克隆抗体的鼠源性（免疫原性）,鼠源氨基酸只占完整抗体分子的1/80~1/3，只保留同抗原特异性结合的活性。制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。2020/1/413基因工程技术为解决问题提供了可能二、抗体工程发展历程及趋势1890年，Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素1937年，Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（α）球蛋白、乙种（β）球蛋白、丙种（γ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。1975年，KöhlerandMilstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。1976年，SusumuTouegava（利根川进）揭示了抗体多样性的遗传学基础。1984年报道了人—鼠嵌合抗体多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体2020/1/4142020/1/415整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术商业化的抗体药物2020/1/4162020/1/4FDA批准的抗体药物全抗体37个（至2014.10月）抗体片段3个ADC3个（1个已撤市）双特异抗体2个Fc融合蛋白7个鼠源嵌合人源化人源ADC1986OKT31994ReoPro1997RituxanZenapax1998SimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrel2000Mylotarg2001Campath2002ZevalinHumira2003XolairBexxar2004AvastinErbitux2006LucentisVectibix2007Soliris2008Cimzia2009StelaraSinponi2010ActemraNumax2011BenlystaYervoyAdcetris2012PerjetaEylea2013KadcylaGazyva2014CyramzaSylvantEntyvioKeytruda2014年全球生物药品销售额前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai12.54RATNF2RemicadeJ&J9.24RA、Crohn’sTNF3RituxanBiogen-IDEC8.678Non-Hopkin’sLymphomaCD204EnbrelAmgen8.538RA、牛皮癣TNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.279I/II型糖尿病/6AvastinRoche/Genentech6.957结肠癌，NSCLCVEGF7HerceptinRoche/Genentech6.793乳腺癌，胃癌HER28NeulastaAmgen4.39白细胞减少症/9LucentisRoche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35贫血及癌症化疗引起贫血/2013年14个抗体药物销售过10亿美元2020/1/419110.265.687.7683.867567.51生物药物专利悬崖Pharmaceuticals2012,5,1393-1408生物技术药物研发热浪涌向中国重磅化药销售Pharmaceuticals2012,5,1393-1408第二节单克隆抗体及其制备2020/1/422一、抗体分子的结构与功能二、单克隆抗体的制备(1)Fab段2个抗原结合片段fragmentwithantigenbinding(2)Fc段1个可结晶片段fragmentcrystallizedPorter木瓜蛋白酶(1)F(ab’)2段1个结合颗粒性抗原出现凝集反应(2)Fc’段1个无生物学活性Nisonoff胃蛋白酶1、酶解片段一、抗体分子的结构与功能（1）、轻链（lightchain，L链）214个氨基酸残基，24KD。分为：κ与λ2个亚型。（2）、重链（heavychain，H链）450-550个氨基酸残基，55-75KD。分为5类，μ、γ、α、δ、ε链。IgM，IgG，IgA，IgD，IgE。2、重链和轻链3、可变区和恒定区（1）可变区（Variableregion，V区）L链N端1/2处（VL）110个aa;H链N端1/5-1/4处（VH）118个aa。HVR1，HVR2，HVR3又分别称为CDR1，CDR2，CDR3骨架区（frameworkregion,FR）高变区（hypervariableregion,HVR）互补决定区（complementarity-determiningregion,CDR），（2）恒定区（constantregion，C区）L链C端1/2处，105个aa;H链C端3/4-4/5处，331-431个aa。在同一种属动物中是比较恒定的,是制备第二抗体进行标记的重要基础。4、功能区链内二硫键折叠成球形区称为功能区，约由110个aa组成。（1）L链：2个，VL，CL各1（2）H链：IgG，IgA，IgD：4个（V区1个，C区3个）IgM，IgE：5个（V区1个，C区4个）（3）功能区的作用：（a）VL和VH：结合抗原决定簇（FV区）（b）CL和CH：具有同种异型的遗传标记（c）CH2：结合补体（d）CH3：结合Fc受体单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，B细胞，NK细胞5、抗体基因结构2020/1/427人类编码Ig的基因分别位于不同的染色体重链（Heavychain)基因：位于14号染色体；轻链基因：κ链基因位于2号染色体；λ链基因位于22号染色体。每条肽链的编码基因可分为V区和C区两大部分。V区的基因是由不同的基因片段拼接而成的重链V区：由V、D、J片段拼接；轻链V区：由V、J拼接。C区拼接决定了抗体的类别（μ、γ、α、δ、ε）胚系重链的基因结构：(a)鼠(b)人重链的VDJ重组2020/1/429轻链基因胚系及重排后结构抗体类别转换2020/1/431V区功能：识别并特异性结合抗原C区功能：激活补体系统：抗体与抗原结合形成复合物可通过启动C1q激活补体经典途径及补体旁路途径；介导免疫细胞活性：抗体的调理作用；ADCC作用；介导超敏反应。穿过胎盘和黏膜：IgG是唯一能从母体通过胎盘屏障转运到胎儿体内的抗体；IgA合成的主要作用部位在黏膜，是黏膜局部抗感染的主要物质。2020/1/4325、抗体的功能2020/1/433抗体功能（C区）-ADCC2020/1/434抗体功能（C区）-CDC2020/1/435IgG4、IgA、IgE二、单克隆抗体及其制备2020/1/4361.抗原与动物免疫2.细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养3.筛选阳性克隆与克隆化4.杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定5.单克隆抗体的大量制备6.单克隆抗体的纯化单克隆抗体制备原理37单克隆抗体制备的基本技术1、抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原；制备特定抗原的单克隆抗体，要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。可以用化学合成：地高辛多数抗原物为混合物用整个肿瘤细胞做为免疫原，经过筛选、克隆化，制备出仅存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞上的表面标志分子的单克隆抗体。免疫动物：BALB/c小鼠或Lou大鼠；目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠。免疫方法：体内免疫和体外免疫(体外致敏淋巴细胞)。体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。颗粒性抗原（细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔1～3周，追加免疫1～2次。可溶性抗原：按10～100μg抗原/小鼠与福氏完全佐剂和灭活的分枝杆菌等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养基本方法：脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*107~3*107）混合，在PEG作用下诱导融合(2min)，用培养液将PEG融合液缓慢稀释。骨髓瘤细胞：SP2/0、P3.653，为缺陷性。PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂；常用浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。为了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合细胞融合的步骤：将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1～10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内200rpm离心7—10分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG0.5ml，随后静置60秒再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用再静置10分钟。可生产有用抗体的淋巴細胞若与癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYY