华中农业大学植科院博士生资格考试复习资料

一全基因组策略1、什么是分子育种？所谓分子育种主要包含两部分内容：一是分子标记辅助育种，二是基因工程或者叫转基因。其中，分子标记辅助育种是将生物技术与传统育种技术相结合而形成的，在水稻、小麦、玉米、大豆、油菜等重要作物上，通过寻找与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记，从基因型水平上实现对目标性状的直接选择，从而加快育种进程，提高育种效率，选育抗病、优质、高产的品种。与转基因技术不同，分子标记育种技术是利用现有的种质资源开展玉米种质改良和育种研究，不存在安全性和市场排斥等社会性和生态性风险。分子标记辅助选择技术在各玉米种业跨国公司已成为常规技术，极大地提高了育种效率。2、什么是全基因组选择？2001年，全基因组选择的概念被提出，即估计全基因组上所有标记或单倍型的效应，从而得到基因组估计育种值。与传统的标记辅助选择的最大区别在于，全基因组选择不仅仅依赖于一组显著的分子标记，而是联合分析群体中的所有标记，以进行个体育种值的预测。在作物遗传育种领域，全基因组选择应用于小麦秆锈病持久抗性和产量等复杂性状的遗传改良已有研究报道。与传统的分子标记辅助选择相比，全基因组选择有两大突破，一是基因组定位的双亲群体可以直接应用于育种；二是更适合于改良由效应较小的多基因控制的数量性状。农作物复杂性状的分子育种需要理解和操控许多因素，其中包括植物生长、发育和对各种生物和非生物逆境条件的反应。通过全基因组策略分子标记辅助育种的操作更加容易，并由此产生革命性影响。全基因组策略的分子标记辅助育种利用全基因组测序和全基因组分子标记对代表性的或者全部遗传资源和育种材料进行分析，有效地考虑分子育种中面临的各种基因组和环境因素。基于对特定基因组区域，基因/等位基因，单倍型，连锁不平衡块，基因网络和这些因素对特定表型贡献的理解，这样的策略正在日益增加。大规模高密度的基因型鉴定和全基因组选择是该策略的两个重要组成部分。高通量和精确的表型鉴定和环境测试（e-typing）也是全基因组策略的重要组成部分。应该此基础上重构有较强的支持系统（例如育种信息学和设计支持工具）的分子育种平台和方法。在这篇文章中讨论了一些基本策略，其中包括（1）基于种子DNA的基因型鉴定，简化分子标记辅助选择，降低育种成本、增加规模和提高效率，（2）选择性基因型鉴定和表型鉴定，结合DNA混合池分析，捕获和育种相关的大多数重要因素，（3）灵活的基因型鉴定系统，例如通过测序和芯片进行基因型鉴定，对不同的选择方法进行细化，包括分子标记辅助选择，分子标记辅助轮回选择和基因组选择，（4）结合连锁作图和LD作图的方法进行标记-性状关联分析，以及（5）基于序列的策略进行分子标记开发，等位基因发掘，基因功能研究和分子育种。二简述一种基于蛋白质水平分析植物基因表达的方法技术原理及应用。常用的方法有双向凝胶电泳联合质谱方法、鸟枪法LC-MS质谱鉴定、抗体芯片方法等。双向凝胶电泳联合质谱的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。胶染色后可以利用凝胶图像分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据，通过与已有的数据库进行比对确定候选蛋白。鸟枪法LC-MS质谱鉴定的基本原理是，蛋白质混合物经过简单或不经过SDS-PAGE分离就被酶切消化成肽段混合物，肽段混合物经过高效液相色谱分离形成较简单的组分，然后将其导入高分辨率质谱仪中进行质量分析。肽段在质谱仪中经离子化后，带上一定量的电荷，通过质量分析器的分析，可检测个肽段的质量与电荷的比值。通过与数据库匹配进行肽段鉴定，最后再从鉴定的肽段推导可能的蛋白。抗体芯片方法抗体芯片是蛋白芯片的一种。它的基因原理是首先制备目标蛋白的特异性的抗体，将不同的蛋白样品用荧光分子标记，再与抗体芯片杂交，杂交信号强弱反应了蛋白的表达水品高低。这三种技术可用于分析作物的不同品种，或不同生理、病理条件下蛋白组的表达差异，有助于鉴定出影响作物品质、抗逆性、产量等形状的重要的蛋白用于植物育种中。三下一代测序技术的种类、原理进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。1）、454技术原理①待测DNA文库的构建。把待测序列用喷雾法(nebulization)打断成300-800bp的小片段并在小片段两端加上不同的接头，或将待测序列变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA(ssDNA)文库。②EmulsionPCR。将这些ssDNA与水油包被的直径大约28μm的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增,扩增产物仍可以结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量。③测序。预先用Bacillusstearothermophilus聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，然后将磁珠放置在一种叫做PicoTiterPlate(PTP)的平板上。PTP板上含有很多直径约为44μm的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置以监测接下来的测序反应。测序反应采用焦磷酸测序法，将一种含有比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。测序反应产生的荧光信号由放置在PTP板另一侧的CCD照相机记录，再经过计算机分析转换为测序结果。由于每种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来确定被测分子的序列。2）Illumina公司的Solexa技术①待测DNA文库的构建把待测序列打断成200-500bp的小片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建ssDNA文库。②DNA与流动槽（flowcell）的附着将这些ssDNA随机地附着在流动槽表面的channel上。流动槽是一种含有8个channel的微纤维板，它的表面固定有很多接头，能支持ssDNA在其表面进行桥式扩增。③BridgePCR向反应体系中添加未标记的核苷酸和酶，进行BridgePCR扩增反应。BridgePCR以流动槽表面固定的接头为模板，经扩增将桥型ssDNA扩增成桥型dsDNA。④dsDNA的变性将桥型dsDNA变性成ssDNA，继续扩增。经过不断的扩增变性循环，每一种ssDNA都在各自的位置集中成束（cluster），每一个束含有单个模版分子的500-1000个克隆拷贝，从而达到能支持下一步测序反应所需信号强度的模板量。⑤测序测序方法采用边合成边测序的方法（SBS）。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。由于这些dNTP的3´羟基被化学方法保护，因而每轮合成反应都只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱。加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，用光学设备完成荧光信号的记录，再通过计算机分析转化为测序结果。当荧光信号的记录完成后，加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP的3’羟基保护基团，以便进行下一轮测序反应。3）ABI公司的SOLiD技术①待测DNA文库的构建把待测序列打断成很小的片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建ssDNA文库。②EmulsionPCR。与454技术的EmulsionPCR类似，将带接头的ssDNA固定在磁珠表面，进行PCR扩增，并对扩增产物进行3’端修饰。③连接酶测序。将3’端修饰的磁珠沉积于上样玻片（slide），进行连接酶测序。在沉积过程中可对磁珠密度进行调节，以达到最大通量。体系中加入DNA连接酶、通用测序引物n和具有3’-XXnnnzzz-5’结构的八聚核苷酸。在这个八聚核苷酸中，第1和第2位（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在第6-8位（zzz）上加了不同的荧光标记。这种由两个碱基决定的测序方法被称为两碱基测序（twobaseencoding）。当八聚核苷酸由于第1和第2位配对而被连接酶连接上时，会发出荧光。在记录下荧光信息后，通过化学方法在第5和第6位之间进行切割，淬灭荧光信号，以进行下个位置的测序。通过这种方法，每次测序的位置都相差五位，即第一次测第1和第2位，第二次测第6和第7位……在测到末尾后，将新合成的链变性、洗脱。而后用通用测序引物n-1进行第二轮测序。第三代测序技术Helicos公司的Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小片段并在3'末端加上Poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。用小片段与表面带有寡聚Poly(T)的平板杂交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应，每一轮反应加一种dNTP。将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。用化学试剂去掉荧光标记，以便进行下一轮反应。经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。四转基因技术的研究进展五基于转录本分析植物基因表达的技术和应用RNA-seq技术见下载的两篇文献六群体改良1群体改良的原理，意义，轮回选择的目的，意义，步骤，作用。群体改良原理：1）Hardy-Weinberg定律（基因平衡定律）：在一个完全随机交配的群体内，如果没有其它因素干扰时，则基因和基因型的频率保持恒定，各世代不变。在一个有性生殖的自然种群中，在符合以下5个条件的情况下，各等位基因的频率和等位基因的基因型频率在一代一代的遗传中是稳定不变的：1,种群大；2,种群中个体间的交配是随机的；3,没有突变发生；4,没有新基因加入；5,没有自然选择。2）选择与重组是群体改良的动力。从育种角度来看，选择和基因重组是群体基因和基因型频率改变主要动力和因素。利用群体进化的法则，通过异源种质的合成，自由交配、鉴定选择等手段，促进基因重组，不断打破优良基因与不良基因的连锁，提高群体优良基因频率和基因型频率，提高育种效率和育种水平。群体改良意义：创造新的种质资源；选育优良的综合品种；改良外来种质的适应性。2自花授粉作物群体改良方法对自花授粉作物或常异花授粉作物进行群体改良工作的关键在于实行生殖控制，即将自花授粉作物异交化，或提高常异花授粉作物的异交程度。可通过导入雄性核不育基因建立异交群体。3提高群体改良效率的方法轮回选择的目的：为育种家提供改良的种质，提高育种群体中的有利基因频率。轮回选择的意义：通过循环式多次交替进行选择和杂交改进作物群体遗传结构，以提高群体中有利基因频率的育种方法。改良的群体可直接用于生产，也可从中选出具有更多有利基因的品种、自交系或综合种。轮回选择的方法：混合轮回选择法；改良穗行选择法；自交后代选择法；半同胞轮回选择；全同胞轮回选择。轮回选择的步骤：确定或合成一个原始杂种群体；从原始群体中选择具有目标性状的个体；当选的优良个体互交，重组，形成一个新群体；再从新群体中进行鉴定和选择，进行另一个新的轮回周期。轮回选择的作用：提高群体内数量性状有利基因频率；打破不利的基因连锁，增加有利基因重组的机会