南医生化实验报告5

生物化学实验报告一、实验目的1.学习并使用盐析法进行蛋白质的初步分离纯化；2.学习并使用凝胶层析法对盐析分离的蛋白质溶液进行脱盐；3.学习并使用离子交换层析法对脱盐的蛋白质进行纯化；4.学习并使用醋酸纤维素薄膜电泳法对血清蛋白进行纯度鉴定。二、实验原理1.盐析法初步提取血清蛋白蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的，以上这两个因素中任何一个受到破坏，都会降低胶体的稳定性，即是蛋白质分子发生聚集进而沉淀出来。由于血清中蛋白质的颗粒大小、所带电荷和亲水程度不同，所以盐析所需的盐浓度也不一样。因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来。2.凝胶层析法对盐析分离的蛋白质溶液进行脱盐用盐析法初布分离得到的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步地纯化，所以必须先将其中的中性盐去除。本实验采用的是凝胶层析法，利用的是蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，分子直径小的无机盐会进入凝胶颗粒的网孔中，而分子直径大的蛋白质不会进入其中。因此在洗脱过程中，大分子的蛋白质会先于小分子的中性盐被洗脱出来，从而达到脱盐的目的。3.离子交换层析法对脱盐的蛋白质进行纯化离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的交换。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂，带负电的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素带正电荷，是一种阴离子交换剂。脱盐后的蛋白质溶液中尚有各种球蛋白，因此可以利用它们等电点不同进行分离。具体原理如下：（1）（2）（3）往离子交换柱中加入0.02mol/LNH4Ac，pH=6.5。清蛋白及α、β球蛋白的pI＜6.5，带负电荷；γ–球蛋白pI＞6.5。、】】＞6.5，带正电荷。清蛋白及α、β球蛋白被层析柱吸附；γ–球蛋白被洗脱。往离子交换柱中加入0.06mol/LNH4Ac，pH=6.5。清蛋白pI=4.9，带负电荷多；α、β球蛋白pI为5.0～5.2，带负电荷少。清蛋白仍被层析柱吸附；α、β球蛋白被洗脱。往离子交换柱中加入0.3mol/LNH4Ac，pH=6.5。缓冲液离子强度增加。清蛋白被洗脱。4.醋酸纤维素薄膜电泳法对血清蛋白进行纯度鉴定醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素做固体支持物的电泳技术。该薄膜具有均一的泡沫结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动阻力小。蛋白质是兼性离子，在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有清蛋白，α-球蛋白，β-球蛋白，γ-球蛋白等蛋白质，每种蛋白质均具有其不同的等电点、氨基酸立体构象和相对分子质量（见下表），因此在同一电场中也具有不同的泳动速度。据此分离后将薄膜置于染色液中使蛋白质固定并染色，可见清晰的条带。蛋白质名称等电点相对分子质量（×104）清蛋白4.886.9α1-球蛋白5.0620α2-球蛋白5.0630β-球蛋白5.129-15γ-球蛋白6.85-7.5015.6-30用此方法分离的蛋白条带从阳极至阴极的顺序为：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。三、材料与方法：1.实验材料样品：健康人血清试剂：20%磺基水杨酸、1%BaCl2溶液、0.3mol/lpH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/lpH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/lpH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/lNaCl-0.3mol/lNH4Ac溶液、饱和醋酸铵溶液仪器：离心机、试管、烧杯、加样枪、层析柱、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、电泳仪和电泳槽2.实验流程取0.8ml血清，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min。沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解。上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白）约0.8ml。将样品过SephadeG-25凝胶柱（1cm×7cm）。用1ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁。继续用2ml0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约1ml。磺基水杨酸检测蛋白质至呈阳性反应，收集含有蛋白质的峰液12d。层析柱所剩溶液可能磺基水杨酸和BaCl2检测同时呈阳性，故继续用0.02mol/LNH4Ac缓冲液洗涤约2ml，直至BaCl2检测SO42-呈阴性。用2-3ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液再生平衡。将样品过SephadeG-25凝胶柱。用1ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁。继续用2ml0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约1ml。磺基水杨酸检测蛋白质至呈阳性反应，收集含有蛋白质的峰液12d。层析柱所剩溶液可能同时磺基水杨酸和BaCl2检测呈阳性，故继续用0.02mol/LNH4Ac缓冲液洗涤约2ml，直至BaCl2检测SO42-呈阴性。用2-3ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液再生平衡。四、结果与讨论：离子交换柱层析纯化。除盐后收集的球蛋白。过DEAE-纤维素层析柱。用1ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁。继续用3ml0.02mol/LpH6.5NH4Ac缓冲液洗脱，流出液量约2ml。磺基水杨酸检测蛋白质至呈阳性反应，收集含有蛋白质的峰液10d。DEAE-纤维素柱无需再生，可直接用于纯化清蛋白。纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）。除盐后收集的清蛋白。过DEAE-纤维素层析柱。用1ml0.06mol/LNH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁。用约5mL0.06mol/LNH4Ac缓冲液流洗，除去α-球蛋白和β-球蛋白。用3ml0.3mol/LNH4Ac缓冲液洗脱，流出液量约2.5ml。磺基水杨酸检测蛋白质至呈阳性反应，收集含有蛋白质的峰液10d。DEAE-纤维素柱先用6mll.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4Ac溶液流洗，再用10ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液流洗再生平衡。1.实验结果醋酸纤维素薄膜电泳结果如下图：2.结果分析本次实验结果显示：所分离提纯的γ-球蛋白和清蛋白较纯，醋酸纤维素薄膜电泳分离情况良好。经查阅资料与和同学讨论得以下影响因素及注意事项：（1）取上清液时尽量全部吸出，但不得吸出沉淀物；（2）当层析柱上的缓冲液面或样品液面刚好下降到凝胶床表面时，注意不要使液面低于凝胶床表面以下，以免空气进入凝胶床；（3）往层析柱加样品或用缓冲液洗脱时，要小心缓慢地加，注意不要讲凝胶粒冲起或破坏凝胶床表面的平整；（4）一定要注意区别检测蛋白质的磺基水杨酸和检测SO42-的BaCl2，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色；（5）洗脱时要注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰流失；（6）葡聚凝胶价格昂贵，要回收再生，避免损耗，严禁倒掉；（7）点样时切勿用力按压，以免破坏醋酸纤维薄膜的内部网孔结构；（8）点样时要注意不要蘸取过多的样品，以免蛋白质含量过高，染色之后着色浅，且蛋白质分离不佳；（9）点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果；（10）电泳过程应选择合适的电流强度，电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散；（11）本次实验所用的试管较多，应做好标记和记录。3.讨论总结（1）硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?因为清蛋白和球蛋白的盐析浓度不一样，使用半饱和硫酸铵溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。（2）为什么实验中DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白?因为DEAE纤维素带正电荷，是一种阴离子交换剂，而γ-球蛋白带正电荷，不与DEAE纤维素结合，会从层析柱中首先洗脱出来。所以DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后可直接用于纯化清蛋白。（3）应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么?蛋白质名称等电点相对分子质量（×104）清蛋白4.886.9α1-球蛋白5.0620α2-球蛋白5.0630β-球蛋白5.129-15γ-球蛋白6.85-7.5015.6-30血清中含有清蛋白，α-球蛋白，β-球蛋白，γ-球蛋白等蛋白质，每种蛋白质均具有其不同的等电点、氨基酸立体构象和相对分子质量（见下表），因此在同一电场中也具有不同的泳动速度。据此分离后将薄膜置于染色液中使蛋白质固定并染色，可见清晰的条带。根据上图数据分析，用此方法分离的蛋白条带从阳极至阴极的顺序应为：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。因此可以根据各蛋白质条带的位置与样品健康人血清各蛋白质条带的位置对比来确定γ-球蛋白和清蛋白。判断纯度的依据是：若分离提纯得到的清蛋白和γ-球蛋白各仅有一条蛋白质条带，其他位置没有条带，则为杂质较少，纯度较高。