分子生物学聚合酶.

SectionK:Transcriptioninprokaryotes(原核生物转录)K1转录的基本原则K2大肠杆菌RNA聚合酶K3大肠杆菌70启动子K4转录的起始，延伸与终止K1:Basicprinciplesoftranscription1.Transcription:anoverview(comparisonwithreplication)2.TheprocessofRNAsynthesis:initiation,elongation,termination转录：双链DNA为模板的单链RNA的酶促合成。RNA聚合酶5’－3’方向K1-1:Transcription:anoverview•MolecularBiologyCourseKeytermsdefinedinthissection(GeneVII)Upstream：在表达方向上处在上方的序列;forexample,细菌的启动子在转录单元的上游,起始密码子在编码区的上游。Downstream：在表达方向上处在下面的序列;forexample,thecodingregionisdownstreamoftheinitiationcodon.RNApolymerases（RNA聚合酶）areenzymesthatsynthesizeRNAusingaDNAtemplate.Primarytranscript（原初转录产物）istheoriginalunmodifiedRNAproductcorrespondingtoatranscriptionunit.K1:Basicprinciplesoftranscription有义链（编码链）反义链（模板链）Promoter（启动子）是基因起始处的DNA序列，即在编码区到5’端（上游）。起始位点:+1位置终止子：转录终止的特定DNA序列。3’5’3’5’转录5’3’+1启动子转录区终止子有义链反义链RNAAACGTTGCAACGFig.2.Structureofatypicaltranscriptionunit相关概念复制与转录复制1DNA分子两个单链为模板——2DNA分子转录DNA双链之一为模板——1RNA单链K1:BasicprinciplesoftranscriptionSynthesisoftheleadingstrandinthesamedirectionasthereplicationforkmoves1.复制SynthesisoftheOkazakifragments1.复制CouplingthesynthesisofleadingandlaggingstrandswithadimericDNApolIII(E.coli).1.复制Transcription:thesynthesisofasinglestrandedRNAfromadouble-strandedDNA2.转录anoverview1.RNAsynthesisoccursinthe5’--3’directionanditssequencecorrespondstothatoftheDNAstrandwhichisknownasthesensestrand(有义链).2.ThetemplateofRNAsynthesisistheantisensestrand(反义链).3.Necessarycomponents:RNApolymerase,transcriptionfactors,rNTPs,promoter&terminatorK1:BasicprinciplesoftranscriptionTheonlydifferenceamongDNAsensestrand(thetranscribedregion)andRNAtranscriptisabasesubstitution(TorU).3’5’3’5’转录5’3’+1启动子转录区终止子有义链反义链RNAAACGTTGCAACGFig.2.StructureofatypicaltranscriptionunitK2E.coliRNApolymerase1.E.coliRNApolymerase2.αsubunit(亚基）3.βsubunit4.β’subunit5.sigma()factorK2-1E.coliRNApolymerase(大肠杆菌RNA聚合酶)RNA聚合酶负责RNA的合成(转录）K2:E.coliRNApolymeraseE.coliRNApolymerase1.能转录各种类型RNA.2.E.coli细胞中最大的酶之一。3.至少有5个亚基组成（α，β，β’，w，）全酶：（2α，β，β’，w，)核心酶：（2α，β，β’，w）4.直接结合16bp的DNA；整个酶覆盖60bp.5.RNA合成速度:40ntpersecondat37oCK2:E.coliRNApolymeraseE.coliRNApolymeraseInitiationonlyBothinitiation&elongation噬菌体T3andT7：RNA聚合酶只有一条多肽链能快速合成RNA(200nt/sec)并能识别自身特异的DNA序列。RNApolymerasediffersfromorganismtoorganismE.colipolymerase:αsubunit在核心酶中有两个由rpoAgene编码对于核心酶的组装是必需的可能在启动子识别中发挥作用.K2:E.coliRNApolymerase3’5’3’5’转录5’3’+1启动子转录区终止子有义链反义链RNAAACGTTGCAACGFig.2.Structureofatypicaltranscriptionunitβsubunit1.β亚基由rpoBgene编码.2.β亚基是RNApolymerase的催化中心3.可能含有两个结构域，分别负责转录的起始和延伸。K2-3&4:βandβ’subunit•利福平：与βsubunit结合,阻止RNApol转录的起始；rpoBgene的突变能导致对利福平的抗性.•利迪链菌素：抑制转录的延伸;抗性的基因突变也在rpoBgene内.β’subunit1.β’subunit由rpoCgene编码2.结合2个Zn2+原子（参与该酶的催化功能）3.β’subunit可能负责酶与模板DNA的结合.•肝素：能结合到β’subunit，在体外抑制转录与DNA竞争结合聚合酶.K2:E.coliRNApolymerase2.factors启动子识别关键，转录延伸并不需要降低核心酶对非特异性序列的亲和力104倍同时增加对启动子的亲和力3.起始完成后，factors会从RNA聚合酶中释放(RNAchainis8-9nt)K2-5:Sigma()factorK2:E.coliRNApolymerase1.原核生物含有多种factors来识别不同的启动子。E.coli中最常见的是70.4.factors数量只有核心酶的30％不同的因子一般基因(rpoD/70)热休克基因(rpoH/32)关闭/开放,热激蛋白(heatshockprotein),环境胁迫,氮代谢基因(rpoN/54)氨饥饿鞭毛基因(fliA/F)鞭毛结构蛋白噬菌体基因枯草杆菌(B.subtilis)(43)因子控制起始•RNA聚合酶的功能双链DNA模板、核苷三磷酸、Mg离子激活、转录起始、RNA链延伸、终止•RNA聚合酶的组成大肠杆菌RNA聚合酶(’w)全酶(2’w－识别和起始)核心酶(2’w－延伸和终止)K3大肠杆菌70启动子1.Promoter（启动子）2.70size3.-10sequence-35sequence转录起始点4.启动子效率K-1启动子定义：RNA聚合酶结合到待转录序列上游的特定起始位点。不同的启动子能导致不同的转录起始速率，whichinturnregulatetranscription.K3-2&3:70promoterK3大肠杆菌70启动子70启动子大小•由40and60bp的序列组成•-55to+20:被聚合酶结合•-20to+20:紧密结合聚合酶•Uptoposition–40:对启动子是必须的•-10and–35sequence:6bpeach,对E.coli中启动子的功能尤为重要。K3大肠杆菌70启动子启动子结构(E.coli)*100种以上启动子的比较结果-10T80A95t45A60a50T96-35T82T84G78A65C54a45*转录起始点90％是嘌呤G多于A*70启动子（E.coli启动子）的共同序列TTGACATATAAT16~18bp5~8bp-35-10起始点CG/AT+1Pribnow框启动子效率不同启动子的序列之间有很大差异，而且其转录效率相差可高达1000倍－35序列：增强与聚合酶因子相互作用的识别区－10序列：对于DNA解旋很重要起始位点附近序列：影响转录起始最初转录的30个碱基序列：控制RNA聚合酶离开启动子，使另一聚合酶得以重新起始转录的速率。K3大肠杆菌70启动子TTGACATATAAT16~18bp5~8bp-35-10起始点CG/AT+1K4转录的起始，延伸与终止启动子结合DNA解旋RNA链起始RNA链延伸RNA链终止Initiation(起始)1.RNA聚合酶与dsDNA启动子结合2.DNAhelix局部解旋3.聚合酶从起始位点的核苷酸处起始RNA链的合成,这个位点被定义为基因序列的+1位置K4:transcriptionFlowchartofRNAsynthesis转录复合物Promoterbinding(启动子结合)闭合复合物：聚合酶与与处于碱基配对状态的启动子DNA所形成的最初的复合物Theroleoffactorinpromoterbinding•TheRNApolymerasecoreenyzme（核心酶）hasageneralnon-specificaffinityforDNA,whichisreferredtoasloosebindingthatisfairlystable.•Theadditionoffactortothecoreenzymemarkedlyreducestheholoenzyme（全酶）affinityfornon-specificbindingby20000-fold,andenhancestheholoenzymebindingtocorrectpromotersites100times.•Overall,factorbindingdramaticallyincreasesthespecificityoftheholoenzymeforcorrectpromoter-bindingsite.DNAunwinding(DNA解旋)DNA的初始解旋导致DNA与聚合酶形成opencomplex（开放复合物）RNAchaininitiation(RNA链起始)Thepolymeraseinitiallyincorporatesthefirsttwonucleotides（核苷酸）andformsaphosphodiesterbond（磷酸二酯鍵）.最初9个核苷酸－流产Elongation（延伸）•核糖核苷酸被添加到正在增长的RNA链的3’-end.•RNA聚合酶沿5’－3’的方向延伸RNA链•酶移动时局部解旋DNA（转录泡）K1:Basicprinciplesoftranscription有义链反义链（模板链）mRNA5’•聚合酶沿5’－3’方向延伸正在增长的RNA链RNAchainelongation(RNA链延伸)Promoterclearanceternarycomplex（三聚复合物）DNA的解旋区（转录泡）17bp杂和双螺旋（12bp左右）转录泡前解旋DNA，之后复旋DNA转录终止:转录复合物的解体和RNA合成的终止，发生在特定的DNA序列即终止子处。