单克隆抗体制备标准化操作方案

单克隆抗体制备标准化操作方案目录第八章附件第一章小鼠免疫小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。好的免疫效果：血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8～12周。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。但有时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。常用的免疫方案：（一）可溶性抗原初次免疫：50～100μg蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠，四周后进行第二次免疫第二次免疫：50～100μg（25～50ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25μg（50～100ug，与初免剂量相同）加强免疫，尾静脉注射，注射体积200μl/只300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫。第三次免疫：50μg蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500μl/只，小鼠融合前三天取抗原25μg加强免疫，注射体积200μl/只。（二）颗粒性（细胞）抗原可用5×106~2×107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2~3周后重复一次，但佐剂改为不完全佐剂，再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。为挑选免疫反应较好的动物进行融合，第二次免疫后10天左右应从尾部取血，检查抗体滴度。另外，还有脾内注射法和体外培养法。第二章饲养细胞的制备体外培养细胞时，一般单个或极少数分散状态细胞是不能存活的（或生长不良）必需加入一定量的其他细胞达一定的密度才能生长得好，加入的细胞称为饲养细胞。用细胞融合术建立杂交瘤细胞时，饲养细胞的加入是不可缺少的，常用的有正常小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞，也有人用经过照射或丝裂霉素处理的纤维母细胞，如3T3或Putler等。一、实验材料1.1RPMI-1640完全培养液：具体配法见实验方法—细胞融合2.3。1.2HAT培养液或HT培养液：具体配法见实验方法—细胞融合2.4和2.5。1.3实验动物：Balb/c或昆明种健康小鼠（雌雄均可）1只，6～10周龄，体重18～22克，本院动物中心繁殖和饲养。每只小鼠可取得3～5×106的滋养细胞，可供铺6块板用，应在融合或克隆前1～2天制备。1.4离心机一台，血细胞计数板，无菌塑料离心管，96孔细胞培养板。小鼠解剖台板或平皿；无菌眼科剪刀、镊子各数把；大镊子一个；止血钳两个。一次性5ml注射器2套。二、实验方法2.1将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精5分钟，随即放入超净工作台内，腹部朝上放于平皿内或固定于解剖板上。2.2用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流。然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。2.3用注射器吸取5mlRPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，晃动小鼠或反复抽吸几次。用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。如此反复操作3～4次。2.41000rpm离心10min，弃上清。2.5用20～50ml完全培养液重悬细胞，100μl/孔滴加到培养板，置培养箱备用。2.6观察饲养细胞的生长状态，一般生长良好的饲养细胞和巨嗜细胞呈梭形或多角形、细胞透亮、折光性强。第三章细胞融合细胞融合是人工定向制造新细胞品系的重要手段，也是制造单克隆细胞系的关键技术。在保证有良好的亲本细胞、稳定和良好的培养体系的条件下，细胞融合的成败和融合率则取决于融合剂和操作技巧。细胞融合的助融剂和助融手段主要有三种；生物学方法：用仙台病毒或鸡新城疫病毒作助融剂。物理学方法：用电融合仪发出的脉冲电流使相邻的两细胞穿孔而融合。化学方法：用聚乙二醇或血卵磷脂作助融剂。PEG作助融剂是比较方便简单的操作方法，具体方法如下：一、实验材料1.1眼科镊子、剪刀数把、固定板。1.237℃温水。1.3酒精灯、离心管架、离心管、离心机、5-10ml吸管、1ml吸管、滴管、计数池、平皿数个。二、实验试剂2.1融合剂：50%PEGW=3000PEG30001gRPMI16401ml8-10磅灭菌2.2基础培养液（RPMI1640）RPMI1640一包(10.4g)L-G（L-谷氨酰胺）0.3gHEPES3.0g碳酸氢钠3.0g庆大霉素一支三蒸水加至1000ml2.31640完全培养液(10%)基础培养液180ml胎牛血清20ml2.4HT培养液（终浓度H为1×10-4M，T为1.6×10-5M）基础培养液197.5mlHT浓缩液（100×）2.5ml胎牛血清50ml一次融合约配250毫升2.5HAT培养液（终浓度A为4×10-7M）基础培养液197.5mlHAT浓缩液（100×）2.5ml胎牛血清50ml2.6细胞冻存液1640完全培养液70mlDMSO10ml胎牛血清20ml2.73%醋酸溶液30%乙酸10mldH2O90ml三、实验步骤3.1脾细胞制备：取加强免疫小鼠一只，眼眶采血后脱臼处死，在75%酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500-2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，白细胞稀释液稀释20倍，计数，取1×108个细胞待用。3.2骨髓瘤细胞制备：取3瓶生长状态良好的（活细胞数95%）骨髓瘤细胞，将之完全吹下，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500~2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，RPMI1640稀释10倍，计数，取2×107个细胞待用。3.3细胞混合：脾细胞:骨髓瘤=5：1，混合，1500-2000rpm离心5分钟。注意：由于细胞融合是个随机过程，母细胞比例不一，会影响融合产物；或是两种母细胞融合而成的杂交细胞，或是一种细胞自身融合产物。多数实验者采用骨髓瘤细胞：脾细胞＝1：5，也有人采取其他比例，如骨髓瘤细胞：脾细胞＝1：5，甚至是1：1。减少脾细胞用量目的是降低脾细胞自身融合的机率。3.4细胞融合：将离心上清倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，在1分钟内加入1ml融合剂，并搅拌细胞，37℃水浴放置45秒，在1分钟内加入1ml1640并搅拌细胞终止融合剂的融合作用，500rpm离心7分钟，弃上清。2分钟内加入5ml1640并搅拌细胞2分钟内加入10ml1640并搅拌细胞2分钟内加入10ml1640并搅拌细胞3.5细胞培养：轻轻将细胞弹匀，缓缓加入HAT培养液至所需体积，将细胞重悬，轻轻地将之混匀，加到预先准备好的饲养细胞板中。10ml吸管滴加1滴（配8ml/板），排枪滴加80~100微升（配10ml/板），37℃，CO2培养箱培养、观察。3.6细胞培养、换液：细胞融合后第一天开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、每孔杂交细胞瘤个数、块数、培养液有无污染、饲养细胞的状况。培养3~5天HAT培养液换液一次，10天换HT培养液培养至20天，换1640完全培养液。四．HAT选择培养液的作用在细胞融合时，可以出现：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，脾细胞之间的融合，骨髓瘤之间融合，此外还有大量的未融合细胞。如何除去大量未融合及自身融合的细胞呢？下面简介HAT液作用。谷氨酰胺（L-Glutamine），尿核苷单磷酸都是正常细胞及肿瘤细胞用来合成DNA的重要成分（主要途径），但是这条途径可以被氨基喋呤（Aminopterin）切断。另外还有一条应急途径即细胞内的HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转化酶）利用（H）和TK（胸腺嘧啶激酶）利用（T）合成DNA。骨髓瘤细胞株是经过8-偶氮鸟嘌呤筛选出来的，不含HGPRT，因此不能借用应急途径合成DNA，只能靠主要途径合成DNA。骨髓瘤细胞在HAT液中，因缺少HGPRT和TK，不能利用H·T合成DNA，主要途径又被氨基喋呤阻断，因此细胞死亡。免疫鼠脾细胞，虽含有HGPRT但不适应体外培养，一般十天左右自然灭亡。杂交细胞，在融合时脾细胞的HGPRT被带入，通过应急途径利用H·T合成DNA，并继承骨髓瘤细胞体外繁殖的特性，所以能存活。一般融合后常用含20%胎牛血清培养液，通过筛选，亚克隆选出有关杂交细胞后，则可换成含10%胎牛血清培养液。对已确定的杂交瘤株，则可换成含5%胎牛血清的培养液培养。第四章筛选分泌抗体的杂交瘤细胞融合后当杂交细胞集落生长到一定大小，培养液开始变黄，便可开始筛选抗体活性。许多方法都可以用来筛选，但应注意到筛选单克隆抗体时的一些特点；首先，培养上清中的抗体含量低于高效抗血清的抗体含量。其次，与普通抗血清不同，单克隆抗体不能多价地识别抗原。所以用来筛选单克隆抗体的方法应照顾到单克隆抗体的特点，而且要准确、迅速和方便。此外应根据所需要抗体的特点，选择不同类型的方法。一般常用的有：免疫荧光、放射免疫（RIA）、组织化学法和酶联免疫分析（ELISA）法等。最经常用方法是ELISA法。在收集上清时，应在上次换液后3-4天进行，以便抗体积累。上清可不经稀释或1：5~1：10稀释后再测抗体活性，用稀释抗体进行筛选时可以筛掉弱阳性的抗体，也可以去掉因高本底所造成的假阳性。融合后第一次筛选出的阳性克隆可能因阴性克隆或其他阳性克隆的过度生长而丢失，故应尽早亚克隆。第一次筛选后也可能没筛选到阳性抗体，这可能由于分泌阳性抗体的细胞为数尚少，应重复测定活性2-3次。现将ELISA法检测杂交瘤细胞抗体的方法介绍如下：（一）实验试剂1．磷酸盐缓冲液（PBS）（10×浓缩）氯化钠（NaCl）50g氯化钾（KCl）1.25g磷酸二氢钾（KH2PO4）1.25g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）18.1g蒸馏水加至1000ml用1MHCL调pH至7.22.封闭液正常牛血清10ml1×PBS（不含吐温）90ml3.洗涤缓冲液吐温-20（Tween20）0.2ml1×PBS1000ml4．底物显色A液醋酸钠（CH3COONa）13.6g柠檬酸（C6H8O7·H2O）1.6g双氧水（H2O230%）0.3ml蒸馏水加至500ml5．底物显色B液乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.2g柠檬酸（C6H8O7·H2O）0.95g甘油（C3H8O3）50ml四甲基联苯胺（TMB）0.2g蒸馏水加至500ml6．终止液（2MH2SO4）取浓H2SO427.62ml，缓缓加入到473ml的蒸馏水中，混匀即可。注意在加入硫酸的过程中，不要加得太快，以免过热。7．抗原包被液（0.1M碳酸盐缓冲液）pH9.6碳酸钠（Na2CO3）1.59g碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g叠氮钠（NaN3）0.2g蒸馏水加至1000ml8．辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（已商品化）。（二）实验步骤1．抗原包被：纯抗原浓度一般为1-2μg/ml，用包被液稀释后取100μl加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃过夜后，洗液洗涤3次。建议4℃包被过夜2．封闭：每孔加200μl或加满封闭液，4℃过夜或37℃两小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。3．ELISA检测（1）加待测样品：检测融合板时，无菌条件下取细胞上清，50~100μl/孔加样到包被好的酶标板中，同时，每板分别选取无细胞生长的两孔为阴性对照，另选取无细胞生长的两孔加入阳性血清作为阳性对照；检测血清或腹水效价时，对血清或腹水做倍比稀释，100μl/孔，以正常小鼠血清为阴性对照，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。（2）加二抗：根据酶标二抗的效