厚朴内生真菌的研究(Ⅰ)菌种分离及其鉴定

厚朴内生真菌的研究（Ⅰ）：菌种分离及其鉴定【关键词】厚朴；内生真菌；多样性摘要：从两个不同来源的厚朴MagnoliaofficinalisRehd.etWils.的茎中，分离获得内生真菌48株，经显微形态观察，鉴定为1纲、3目、6科、16属。不同来源的厚朴内生真菌的种群、数量及分布部位存在显著差异。关键词：厚朴；内生真菌；多样性StudyonEndophyticFungiinMagnoliaofficinalisRehd.etWils.（Ⅰ）:IsolationandIdentificationofEndophyticFungiAbstract：48strainsofendophyticfungiwereisolatedfromthestemofMagnoliaofficinalisRehd.etWils.Theyweremorphologicallyidentifiedbelongingto16genera,6families,3ordersand1class.Theresultoftheexperimenthasshownthatquantity,speciesanddistributingoftheendophytesvariedinMagnoliaofficinalisRehd.etWils.ofdifferenthabitat.Keywords：MagnoliaofficinalisRehd.etWils.；Endophyticfungi；Diversity厚朴MagnoliaofficinalisRehd.etWils.是著名的川产道地药材,属国家二级保护的珍惜濒危药用植物。用于湿滞伤中，脘痞吐泻，食积气滞，腹胀便秘，痰饮咳喘等病症［1］。厚朴多以复方入药，用量较大；而厚朴原植物生长周期长，曾出现厚朴资源匮乏，采用环剥技术确保进行了枝皮剥除的植株能继续生长的方法来保存资源的现象。现在厚朴虽已进行大面积规模化种植，但从长远观点看，厚朴资源仍显不足。植物内生真菌能够产生与宿主相同或相似化学成分这一特性在一定程度上可以缓解植物资源短缺问题。厚朴内生真菌的研究未见报道。笔者对厚朴内生真菌进行了菌株分离、鉴定等工作。现将研究结果报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1来源采集四川峨眉山唐山健康植株的枝条；四川都江堰市虹口乡健康植株的枝条作为样本。原植物经鉴定为厚朴MagnoliaofficinalisRehd.etWils.。1.1.2培养基PDA培养基（马铃薯培养基）（用于培养）、PDA培养基＋青链霉素混和液（用于分离）、查氏培养基（NaNO3，K2HPO4，KCl，MgSO4，FeSO4，蔗糖）（用于鉴别）、促孢培养基（KH2PO4，KNO3，MgSO4・7H2O，KCl，淀粉，葡萄糖，蔗糖）（用于鉴别）。1.2方法1.2.1内生真菌的分离用自来水将新鲜植物表面洗净，稍干后切成适宜长度的小段，在75％酒精中浸泡3～5min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干。然后用无菌刀片将组织表皮削去，分别取韧皮部、木质部和髓部切成5mm×5mm×1mm的小块贴放于分离培养基上，置25～28℃恒温箱中培养3～20d，待培养基上各植物组织周围长出菌丝后，采用尖端菌丝挑取法对所分离的内生真菌进行纯化，即得内生真菌。1.2.2内生真菌的鉴定采用插片培养和点植法，对分离获得的银杏内生真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定。分类检索参照文献［2,3］。2结果与讨论2.1厚朴内生真菌种群多样性分析从厚朴中共分离出48株内生真菌，经显微形态观察，鉴定为1纲、3目、6科、16属。厚朴内生真菌种群组成见表1。表1厚朴内生真菌种群组成（略）由表1可以看出，厚朴内生真菌在种类上存在着极其丰富的多样性特征。在厚朴内生真菌中，从数量上看，以曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和镰孢属（Fusarium）为优势种群，包含菌株分别占总菌株数的31.3％，18.8％，14.6％。部分属种代表性显微形态特征参见图1～6。2.2不同采集地点厚朴内生真菌的分布从不同地点采集的厚朴植株中均分离到了一定数量、不同类群的内生真菌，表明内生真菌在厚朴体内广泛存在。不同采集地的厚朴中内生真菌的优势菌群不同。其中，采集于峨眉山唐山的厚朴优势菌群为青霉属（Penicillium）；采集于都江堰市虹口乡的厚朴优势菌群为曲霉属（Aspergillus）。结果见表2。图1葡萄孢Botrytissp.显微特征（略）图2镰孢菌Fusariumsp.显微特征（略）图3阜孢霉Papulariasp.显微特征（略）图4胶帚霉Gliocladiumsp.显微特征（略）图5曲霉Aspergillussp.显微特征（略）图6青霉Penicilliumsp.显微特征（略）由表2可以看出，采集于峨眉山的厚朴植株中的内生真菌在种类上较之采自都江堰者显得丰富，两地植株中分离出的内生真菌数量相当。镰孢属（Fusarium）为不同来源厚朴植株的共有菌群，而两地植株的优势菌群也成为各自的特有菌群之一。表2不同采集地点厚朴内生真菌数量及种类分布情况（略）本次实验从两个不同来源的厚朴中共分离到48株内生真菌，经鉴定为1纲、3目、6科、16属，显示出该植物内生真菌在种类和数量上的多样性。采自不同地点的厚朴植株内生真菌种群差异较为明显，采集于峨眉山唐山的厚朴优势菌群为青霉属（Penicillium），而采自都江堰市虹口乡的厚朴优势菌群为曲霉属（Aspergillus）。镰孢属（Fusarium）是不同来源厚朴植株的共有菌群。采集于峨眉山的厚朴植株中的内生真菌在种类上较之采自都江堰者显得丰富。我们认为这与采集地的具体环境及厚朴的树龄有关。树龄较长的植株能够提供给微生物一个相对较长的与宿主之间的“磨合期”，使一些致病菌转变成暂时不致病的内生菌，内生真菌的种类也就相对较多。这再一次表明，植物内生真菌的数量和种类与植物自身状况及其所处环境密切相关。有关厚朴内生真菌中活性菌株的筛选研究，将在随后的文章中给予报道。作者：庞蕾，严铸云，郭晓恒，罗静，万德光《时珍国医国药》参考文献：［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：176.［2］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979.［3］H.L巴尼特，B.B亨特著，沈崇尧译.半知菌属图解［M］.北京：科学出版社，1977