原位杂交手册

第1章共用程序引言：本章介绍了本实验最基本的实验程序，包括中期染色体制片；质粒的转化与DNA的提取；探针标记检测以及基因组总DNA的提取第1节原生质体染色体制片试剂：饱和a-溴萘、0.075MKCl、固定液（新鲜3：1甲醇冰乙酸）、酶解液（20%纤维+2%果胶酶）、INHCl、95%酒精实验步骤：浸种室温下浸种约一天（也可1-2h）发芽培养皿中垫湿滤纸三层，利子分散其上，间留间隔，勿堆积，种子上层覆盖一层水浸湿的滤纸，25-30℃下发芽，每天水洗一两次，约2-3天可取根。NOTE：换水是很重要的，水不能过多，以不留流动水为好，水分过多易长芽而根长不好。预处理方法1：根长至1.5-2cm长时切取1.5mm左右的根尖，饱和a-溴萘约25℃处理2-3小时，水稻一般不预处理。方法2：根长好后将种子置于4℃冰箱处理一个晚上，第二天在25℃下恢复2-3h，也可得到许多分裂相。NOTE：何进取根尖最好具随机性，与季节以及细胞分裂时期很有关系。（玉米8:00AM，水稻11:00-12:00AM）水洗反复几次前低渗ddH2O或0.075MKCl（0.6KCl溶于100mlddH2O）低渗30min（室温）。固定新鲜3∶1甲醇冰乙酸固定2-3小时或4℃过夜。NOTE：一定要用新鲜固定液；如果用于石蜡切片组化显色，甲醇固定的材料会导致很高背景，应换用4%多聚甲醛。水洗反复几次，洗净。酶解2%纤维素酶+2%果胶酶混合（1∶1），28℃下处理3小时左右。NOTE：酶解是最至关重要的一步，首先是酶的质量，很多酶都可导致分裂相少，以SERVA公司的果胶酶为最好，根据材料不同，酶解时间会有所变化。洗载片载片一定要干净，以防材料脱落和保持清洁的背景。洗片步骤：1）INHCl中3min以上2）自来水洗（每片单独漂洗）接着用双蒸水洗3）95%酒精浸泡30min以上（每片单独放入）制片小心吸去酶液，水洗几次，吸取1-2个根尖于干净的干载玻片上，滴半滴固定液，用镊子敲至浆状，滴2-3滴固定液使材料分散，火烤至着火。NOTE：敲得越碎越好，敲至固定液干后，再滴固定液，迅速涂开，火焰干燥，干燥后肉眼观察应为规则干净的小雨点状，若小雨点上像有一层不透明的薄层，说明酶解时间不够。镜检检后将符合要求的制片储存于-20℃下备用。NOTE：每张制片上至少应有150个左右分散良好但背景干净的分裂相方可用于杂交。REFERENCES第2节质粒的转化与扩增若寄来的探针是插在质粒中cDNA克隆或基因片段，首先要对其进行转化，一般利用E.Coli作为载体，转化的关键在于如何制备感受态的E.Coli细胞，本实验利用CaCl2来制备感受态细胞，此方法简便、快速。试剂：LB培养基，0.1MCacl2，70%甘油实验步骤：感受态E.Coli的制备从-20℃下取2-5µlE.Coli，涂在平板上，37℃培养16-20h。挑取单个菌落于20ml已预热至37℃的LB培养基(不含Amp)中，37℃，300rpm剧烈振摇约3h。培养物转移至4支预冷的5mlEppendorf管,冰上放10min，4000rpm离心3-5min，回收细胞（4℃）；倒出培养液，倒置lmin。以5ml预冷的0.1MCacl2重悬每份沉淀，冰浴30min。4000rpm离心5min（4℃）；倒出培养液，倒置lmin。每管加预冷的0.1MCaCl20.25ml，重悬细胞，冰浴lh每管100µl分装,保存于-20℃下,长期保存转化效率会有所下降。质粒DNA的转化取-20℃保存的感受态细胞二支，冰上溶解10min，一支加质粒cDNA(10µl，30ng)，混匀，另一支作为对照，冰浴30min。42℃水浴放置90秒，保持1-2min。快速置于冰浴，保持1-2min。每管加200-300µl培养基，用水浴加热至37℃。37℃摇床温育45min。扩增（无菌操作）将温育后的转化细胞转移至含抗生素（100µg/mlLB）的LB平板上。当液体被培养其吸收后，倒置平板，37℃培养12-16h，时间不宜过长。菌落生成后，挑取单个菌落，37℃于LB液体培养基中培养24h左右。加70%甘油，-20℃保存。第3节质粒DNA的提取试剂：LB固体培养基，LB培养基，Sol.Ⅰ，Sol.Ⅱ（当配当用），Sol.Ⅲ，Sol.VI，异丙醇，70%酒精，RNaseA，100%EtOH，TE溶液实验步骤：活化含重组质粒细菌用划线法接种在LB固体培养基上，37℃培养箱培养过夜。扩增挑选单个菌落接种在含20µlAmp的20mlLB培养基中，摇床，250rpm，37℃培养16-18小时，至溶液混浊，但不能培养过久。离心两支5mlEppendorf分装一半，8,000rpm（过高速度的离心会导致沉淀物难以悬浮Sol.Ⅰ）离心10-15min，去上清液，再倒入另一半，重新离心，去上清，沉淀合并。裂解Sol.Ⅰ，200µl，振荡混匀。（确使细菌沉淀完全分散）Sol.Ⅱ，300µl，（当配当用）振荡5秒钟，然后冰上10min。（快速颠倒离心管5次，以混合管内容物）Sol.Ⅲ，400µl，振荡5秒钟，置冰上10-15min以上。（盖紧管口，将管倒置后温和振荡10秒，冰上3-5分钟）离心13,000rpm离心10min，上清液转入1.5mlEppendorf管中。抽提加入等体积Sol.VI，至乳浊状，10,000离心5min。沉淀吸上层水相至新的Eppendorf管中，加等体积异丙醇（或无水乙醇两倍体积），振荡30秒钟，然后置于-20℃下沉淀DNA，至少2h。收集12,000rpm离心10min后，去上清液，37℃干燥。洗涤加70%酒精洗涤2-5min，12,000rpm离心10min，同上干燥。NOTE：用于DNA原位杂交的探针，从此步骤直接进入最后一步（溶解保存），但用于RNA原位杂交的探针，必须还经后续RNaseA处理及抽提步骤。溶解加入50µlddH2O溶解，在4℃下溶解30-60min。RNaseA处理加入2.5ul10mg/ml，37℃处理1h。抽提再加入50ulddH2O，加入100ulSol.VI混匀，10,000离心5min。沉淀吸上层水相至新的Eppendorf管中，加2×体积100%EtOH沉淀过夜。收集12,000rpm离心10min后，去上清液，37℃干燥。保存加入20µlTE溶液，在4℃下溶解30-60min（一般20ulTE溶解5ml菌液提取的质粒最终探针浓度约为0.4ug/ul，不计载体），然后转入-20℃冰箱保存，或用75℃水浴15min后转入-20℃冰箱保存。NOTE：为了使双色FISH一定体积杂交液中探针浓度达一定值，此处控针浓度不能太小。酶切反应体系质粒DNA1ug(约3-4u1)ddH2O至终体积15ul10×Buffer1.5ulEnzyme2.5U混匀，适当温度下（一般为37℃）反应45~60min电泳鉴定1~2%的琼脂糖电泳鉴定，每条泳道两条带说明酶切完全。碱变性提取质粒用So1.I-IV的配制So1.I100ml（灭菌10磅15min.4℃保存）成份用量终浓度分析纯葡萄糖（glucose）1.0MTrisCl-8.00.5MEDTA-8.0ddH2O0.9g2.5m12.0ml至100ml50mM25mM10mMSol.II包括a,b两种，用时掺合成份掺合比工作浓度10%SDSSDS4g100ul1%ddH2O约35ml稀碱调Ph7.2(变化快)ddH2O至40ml10MNaOHNaOH40g20ul0.2MddH2O至100mlddH2O880ulSol.III（3MKAc）100mlKAc25.2gH2O80ml冰乙酸（约11.5ml）Ph5.5H2O至100ml（灭菌，4℃保存）NOTE：［K＋］为3M，[Ac]为5MSol.IV平衡酚:氯仿:异戊醇=25:24:1（可改为氯仿:异戊醇=24:1）附：平衡酚步骤：重蒸酚在68℃左右溶解后，加入等体积0.1MTris-C1-8.0（含0.2%β-巯基乙醇），激烈振荡，加入固体Trisbase调pH。待分层后，测得上层水相pH在7.0以上（可在加入1g/100ml左右Tris后，pH仍在7.0以下时去水相，再加1MTris反复萃取直至水相pH至7.0以上）。收集下层有机相于量筒，迅速测定体积后，再迅速转移至棕色瓶中，并覆以1/10体积的0.1MTris-Cl（含0.2%β-巯基乙醇）。第4节探针标记基本知识标记应考虑的总是主要有两点：标记物和标记方法。一般原位杂交中标记物都是用非放射性标记，而Southern杂次中用放射性标记，非放射性标记的标记稀常见珀有三种，Fluorescein-dUTP,Bio-dUTP和DIG-dUTP,Fluorescein-dUTP标记称直接标记，快速、简便、背景低、但灵敏度不高，适于检测重复序列。后二者标记称间接标记，可以在杂交后对信号进行级联放大，适于检测单/低拷贝序列。标记方法主要有四种：DNaseⅠ/DNAPolymeraseⅠ介导的切口平移法（NickTranslation）；Klenow介导的随机引物法；末端转移酶（TdT）介导的末端标记法以及Taq酶介导的PCR法，对于lkb的探针，建议采用切口平移法；随机引物法标记效率比切口平移高，更适合于100bp-lkb探针的标记；而对于100bp的探针，则需要用末端标记法；但如果你手头的探针量很少（少至50ng），相应引物的话，PCR是最佳选择，简便快速，可制备大至4kb的探针。实验步骤4.1切口平移标记法(Biotin)本实验室用于中期染色体原杂交的探针一般用生物标记。依次加入下列试剂于1.5mlEppendorf管中：探针数123终浓度(50ul中)dNTP10203030uMofeach10×Buff510151×Bio-11-dUTP481230uMddH2O265278DNaseⅠ(0.75ng/ul)2.557.51.88ngDNAPol.Ⅰ12U(2.5ul)24U36U12U质粒DNA(~0.4ug/ul)取上述混合液45ul，加相应探针5ul1.5～2ug15℃下反应2.5h,加5ul终止液(Stopsolution)终止。NOTEDNAPol.Ⅰ的量应参照各厂家提供的浓度，以每50ul标记液中含12U为准。原位杂交探针的合适长度为300～600bp，照此系统标记中DNaseⅠ用量，一般可达到这一目的；若为NT试剂盒，其提供的浓度应已考虑这一参数，因此酶量应已优化。现在标记一般用华美公司试剂盒[包括10×Buffer、消毒三蒸水、dNTP、stopsolution（0.5MEDTA）]。4.2纯化已标记的探针：制作柱子在0.5ml微Eppendorf管底部用青霉素皮试探头刺孔，将少量硅化玻璃丝加在底部，套入去底的1.5ml微Eppendorf管中，再置于15ml培养管中，加入750µlSepharoseCL-6B于穿孔微Eppendorf管中，25,00rpm离心5mim。用另一新1.5ml微Eppcndorf管更换，贴上Prode标签。在作好的新鲜柱子上，立即加入已标记的Probe（注意柱子一定要当作当用），25,00离心10mim。测定纯化后Probe的体积，储存于-20℃下备用。4.3其它探针标记方法：用于多色FISH或Fiver-FISH，除用生物素标记外，至少还要用到另一种标记物，一般也为地高辛（Digoxigenin/Digoxin，DIG）；而用于SouthernBlotting时，则一般用同位素（Isotope）标记，也可用DIG标记。介绍两种试剂盒的标记方法（试剂盒上有）DNaseⅠ/DNAPolⅠ介导的切口平移标记法(32P)(NickTranslationLabelingKit，Promega)Klenow介导的随机引物标记法(DIG)(DIGLabelingandDetectionKit，B.M.)反应体系（50ul）反应体系（50ul）dNTP（dATP,dTTP,dGTP）10×Buff回收的Probe（不含载体）ddH2ODNaseⅠ/