动物蛋白质粗提实例

大连湾牡蛎蛋白的分离提取及分子量测定崔韶晖，王艳颖，崔杰，王岩，左明，宁洪良1、试剂Tris—HCI、SDS、2-巯基乙醇、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、葡聚糖凝胶G-100(SephadexG一100)为进口分析纯试剂；冰醋酸、NaCl、Glycine、甘油、溴酚蓝、过硫酸铵、考马斯亮蓝、甲醇、标准蛋白(Marker)、牛血清蛋白等为国产分析纯试剂．2、仪器FSH-2型可调高速匀浆器、TDL-40B大容量低速离心机、旋转蒸发仪(BUCHI)、紫外分光光度仪、垂直板电泳装置(安玛西亚)、凝胶成像分析仪(ImageStation440CF，KODAK)、脱色摇床、层析柱(1.0x30cm)等．3、实验方法1制备牡蛎匀浆用自来水清洗新鲜牡蛎，除去内脏，再用去离子水冲洗干净，取5个为一组放入匀浆杯中，调速7000～10000转将牡蛎匀浆破碎成浆状组织液体．2冰醋酸粗提牡蛎中蛋白组分向匀浆液中滴加足量的冰醋酸，边滴加边用玻璃棒搅匀，直至匀浆液不再粘稠为止，静置10min，使冰醋酸与蛋白充分反应，移人离心管中离心分离，转速4000r／rain离心20分钟，反复提取2次，合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩提取。大鼠肝细胞过氧化物酶体的提取骆子生王敏彦姜玲玲1.1动物健康SD大鼠,体重300g左右，鼠龄2～3个月。由河北省实验动物中心提供。1.2试剂所用试剂均为国产分析纯试剂。1.3主要仪器日立80P—7超速离心机，RPS40T水平转头，日立UV330紫外—可见分光光度计。4、过氧化物酶体的分离大鼠断头处死后，立即取出肝脏，用冷生理盐水将血迹冲洗干净。称取10g肝脏，用剪子剪碎后，加50ml提取缓冲液(蔗糖0.25mol/L，乙醇0.1%，Na3EDTA1mmol/L，Tris-HCl，pH7.4，10mmol/L)，在冰浴中匀浆(以下操作均在冰浴中进行)。④肝匀浆3000r/min、离心10min，除去组织块，取上清液备用。⑤向沉淀中加入50ml提取缓冲液再次匀浆，肝匀浆3000r/min、离心6min，弃沉淀(A)。将两次离心所得上清液合并，7000r/min、离心5min，取上清。13500r/min、4℃离心20min,弃上清(B)，留沉淀。⑥向沉淀中加入40ml缓冲液混悬后，再次13500r/min、离心20min，弃上清，取沉淀。用3ml缓冲液将沉淀悬浮，此为过氧化物酶体的粗提物(C)。⑦在13ml的PA离心管中加入45.8%(w/w)的蔗糖液5ml，再缓慢加入37.4%(w/w)的蔗糖液4ml，制成不连续梯度液。将混悬好的过氧化物酶体的粗提物(约4ml)缓慢加在梯度液上，用RPS40T水平转头，慢加速至27500r/min、离心2h。⑧样品被分成肉眼可见的三层分布状态(见图1)：上边一层是微粒体，中间一层是线粒体，最底部沉淀即是过氧化物酶体。收集管底的沉淀，用13ml提取缓冲液悬浮，27500r/min、离心2h，洗去浓蔗糖溶液。东亚钳蝎纤溶活性蛋白的分离纯化及其作用性质研究黄锦兵1、主要实验仪器组织捣碎机：佛山市顺德区方胜电器实业有限公司KDC-40低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司JB-2型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司AUY220电子分析天平：梅特勒一上海HC—TPll—5架盘药物天平：上海精科天平KDC-160HR高速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司DHG一9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司TH-500梯度混合器：上海沪西分析仪器厂有限公司HL-2恒流器：上海沪西分析仪器厂有限公司BSE-100自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司UV-180紫外检测仪：上海沪西分析仪器厂有限公司XWT-S小型台式记录仪：上海自动化仪表三厂1810B自动双重纯水蒸馏器：上海建强玻璃仪器有限公司梅特勒一托利多SevenEasypH计：梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司2、主要实验试剂：磷酸氢二钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂磷酸二氢钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂硫酸铵：分析纯，天津市福晨化学试剂厂三(羟甲基)氨基甲烷：分析纯，天津市大茂化学试剂厂盐酸：分析纯，广州市东红化工厂氢氧化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂乙二胺四乙酸二钠(EDTA)：分析纯，广州化学试剂厂氯化钡：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司聚乙二醇10000：实验试剂，天津市瑞金特化学品有限公司氯化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂D45nm透析袋：美国进口DEAE-32纤维素：广东省汕头市西陇化工厂进口分装(沃特曼产品)无水乙醇：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司考马斯亮蓝G-250：USB，北京鼎国生物技术有限责任公司磷酸：分析纯，天津市大茂化学试剂厂1总蛋白的提取1溶液的配制：pH=7.6，浓度为0.02mol/L磷酸钠缓冲液的配制取6.053gNa2HP4·12H20，0.4863gNaH2P04·2H20定容至1LpH=8.0，浓度为0.02mol/LTris-HCl的配制取973.33μL浓盐酸，2.4228gTris定容至1L2实验材料准备：1．透析袋的处理：新的透析袋在使用前必须要进行前处理，具体方法如下：⑴先把把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段。⑵在大体积的2％(W/V)碳酸氢钠和lmmol/LEDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。计算2％(w/v)的NaHCO3溶液和lmmol/LEDTA(pH8.0)的用量：若m(NaHCO3)=2g，则V(NaHC03)=2/2％=100ml，则需NaHCO3溶液l00ml。若需EDTA溶液500ml，而m(EDTA)=1×l0-3mol/L×0.5L×292.25g/mol=0.1461g。即称取0.1461g的EDTA粉末，溶于水，定容至500ml即可。(3)反复用蒸馏水冲洗透析袋的内部及外部。(4)放在lmmol/LEDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。(5)冷却后，存放于4℃冰箱内，必须确保透析袋始终完全浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时总须戴手套。(6)使用透析袋前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。注：步骤4，用lmmol/LEDTA(pH8.0)煮沸10分钟的操作，可代之以将透析袋装于盛满水松盖瓶内，在201bf/in2(1.379×105Pa)高压下蒸汽灭菌l0分钟。2．DEAE-32纤维素预处理：称取DEAE-32纤维素18g，采用以下方法前处理：(1)加180mL离子水于DEAE-32纤维素中，浸泡溶胀24小时。(2)倾去凝胶溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0mol/LHCl液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5小时预处理后倾去。用去离子水洗涤至中性。(3)倾去凝胶上层的水及悬浮碎片后，加入凝胶等体积的1.0mol/LNaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5小时处理后，用去离子水洗涤。洗涤过程中，用倾去法去细颗粒。(4)重复步骤2的操作。(5)倾去凝胶上层的水后，加入凝胶等体积的0.0lmol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液，用搅棒轻轻搅动平衡。倾去凝胶上层的Tris—HCl缓冲液，重复平衡3次。(6)将DEAE-32纤维素凝胶溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡。将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入盛有Tris-HCl缓冲液的烧杯中，备用。3、提取步骤：1．取东亚钳蝎剪尾，分别对蝎尾和蝎身称重，高速组织捣碎机进行捣碎，加入5倍蝎尾和蝎身重量体积(V/W)的磷酸钠缓冲液，预冷，磁力振荡搅拌器搅拌30分钟，4℃浸提过夜。2．滤液在4℃下8000r/min离心20分钟，取上清液，即为蝎尾蝎身粗提液。3．采用(NH4)：S04溶液饱和度的方法，分别以40％、70％的盐饱和度对蝎尾蝎身蛋白质粗提液进行分段盐析，硫酸铵溶液饱和度的计算参见表2-1。参照表2-1计算4096硫酸铵饱和度需要硫酸铵的质量，缓慢加入到蝎尾蝎身粗提液中，4℃预冷，放在磁力搅拌器上搅拌30分钟使硫酸铵完全溶解，4℃静置l小时，然后在4℃条件下8000r/min离心20分钟，手机上清液。采用同样方法调整硫酸铵饱和度到70％进行盐析，收集沉淀，用磷酸钠缓冲液溶解，4℃保存，备用。4．把收集得到的待测液装入预先处理好的45mm透析袋中，先用双蒸水4℃透析4小时，然后用Tris-HCl缓冲液进行透析，中间多次换缓冲液，至到用氯化钡溶液检测不出白色硫酸钡沉淀为止。5．把透析完的透析袋放到聚乙二醇10000中进行浓缩，过滤浑浊的待测液，4℃保存备用。最后用沸水煮用过的透析袋二十分钟，然后放入双蒸水中，冰箱保存即可重复使用，聚乙二醇放入烘箱蒸干其水分以便下次使用。怀头鲇胃黏膜蛋白酶分离提纯条件的筛选刘伟，曾真，战培荣胃蛋白酶的粗提(粗分级)1)采样时间。怀头鲇胃黏膜蛋白酶活性在摄食后3h达到高峰，故在喂食后3～4h进行采样。2)酶原抽提。在冰盘上解剖怀头鲇并剪下整个胃部，用蒸馏水清洗，再剪去胃外壁肌肉，保留内壁黏膜组织。将黏膜组织剪碎，加入4倍质量的双蒸水，用高速匀浆器以10000～13000r/min低温匀浆2h(每5min间歇匀浆lmin)。若匀浆中有较多组织碎块，应尽可能剪碎黏膜组织。再将匀浆液以8000r/min冷冻离心15min，上清即为胃蛋白酶原抽提液，蛋白酶活力为0.516IU/mg。3)酶原激活。用1mol/L的盐酸将胃蛋白酶原抽提液pH调至2.8，静置2h，酶原被激活为有活性的蛋白酶，即胃蛋白酶激活液，蛋白酶活力为61．95IU/mg。将胃蛋白激活液用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.2，并于4℃下保存。人单核细胞表面晚期氧化蛋白产物结合蛋白的分离孙岩晚期氧化蛋白产物的制备分离AOPP的形成主要依赖于氯化氧化剂，特别是HOCI的作用，而在血浆中，HSA是形成AOPP最主要的蛋白组分，因此目前主要通过HSA--HOCI孵育法由体外制备AOPPf称为AOPP-HSA)。我们首先以此种方法制备AOPP—HSA粗纯品，继而先后通过SephadexG-100凝胶层析和Mono—Q阴离子交换一HPLC分离其中I鬟JAOPP—HSA，测定其纯度。材料一、主要仪器l、Orion868pH计英国Thermo2、Ultrospec4300pro紫外/可见光分光光度计美国3、深低温冰箱日本SANYO4、BiologicLP低压层析系统美国Bio-Rad5、负压冷冻机英国Thermo6、Water484HPLC系统美国Waters7、SUMMITHPLC系统德国戴安8、EDS-99细菌内毒素定量测定系统湛江安度斯公司二、主要试剂1、次氯酸钠(NaOCl)重庆北碚化学试剂厂2、乙二胺四乙酸(EDTA)上海生工3、人血清白蛋I刍(HSA)美国Sigma4、碘化钾(KI)重庆化学试剂厂5、醋酸重庆北碚化学试剂厂6、氯胺-T天津天泰精细化学品有限公司7、牛血清白蛋白(BSA)美国Sigma8、考马斯亮蓝G-250上海生工9、SephadexG-100凝胶美国Pharmacia10、Mono-QHR5/5阴离子交换柱美国Pharmacia1l、C8分析柱德国戴安12、三氟乙酸(TFA)美国Sigma13、乙腈美国Sigma14、内毒素(LPSO11l：B4)湛江安度斯公司15、内毒素检测用水湛江安度斯公司16、鲎试剂湛江安度斯公司17、D—SaltTM葡聚糖去盐柱美国Pierce18、透析袋(截留相对分子量8kD～1.4kD)华美分装三、主要试剂的配制l、0.01mo1/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)，pH7.4(如无特殊说明，文中PBS即为0.0lmol/L，pH7.4)NaCI8gKCl0.2gNa2HPo4．12H202.772gNaH2Po4．2H200.353g以800ml三蒸水完全溶解，25℃调整pH值至7.4，定容至1000ml，室温贮存。2、10mol/LNaOH40gNaOH在塑料烧杯中缓慢加到80ml三蒸水中，搅拌至完全溶解，定容至100ml，室温贮存。AOPP—HSA粗纯品的制备1、Na