发酵法生产谷胱甘肽的研究进展

谷胱甘肽发酵法生产的研究进展摘要：谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的具有多种重要生理功能的活性三肽，对维持生物体内合适的氧化还原环境起着关键作用，被广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。发酵法已成为目前生产谷胱甘肽最常用的方法，但现有生产能力还不能够满足市场需求。本文主要针对发酵法生产谷胱甘肽的关键技术环节，包括菌种选育、工艺优化、过程控制的研究进展进行一个综述。关键词：谷胱甘肽发酵生产菌种选育工艺优化过程控制谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一种缩合而成的含C-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽类化合物，在蛋白质和DNA的合成、氨基酸的转运、细胞的保护等重要的生物学现象中起着直接或间接作用。它主要分布于动物、植物、微生物细胞中，被广泛应用于临床医学、运动保健、食品加工等很多领域。因此，GSH已成为各国科学家研究和探索的热点。1谷胱甘肽的性质及功能虽然GSH的研究已经日益受到关注，但大家对其理化性质及生理功能的了解并不够全面。而对这些基本信息的掌握，恰是我们更进一步探索谷胱甘肽各项作用机理的前提。1.1谷胱甘肽的理化性质GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的具有多种重要生理功能的活性三肽，化学名称为C-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸(C-L-Glutamy-lL-Cysteiny-lGlycine)。GSH的相对分子质量为307133，熔点189~193℃(分解)，晶体呈无色透明细长柱状，等电点为5.93，溶于水、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。GSH分子中含有一特殊肽键C-谷氨酰胺键，其保护肝脏等许多特殊性质均与此肽键有关；GSH分子中含有一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢，2分子GSH脱氢后转变为1分子氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSH广泛存在于自然界中，动物肝脏、酵母和小麦胚芽中都含有丰富的GSH，其含量为1~10mg/g，人和动物的血液中也含有较多的GSH，而植物组织中的GSH含量则较低。1.2谷胱甘肽的生理功能GSH在生物体内有着多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用。GSH的生理功能主要有以下几个方面：（1）保护肝脏，治疗各种肝类疾病GSH强大的还原作用使肝细胞膜对氧自由基的耐受性增加，从而使GSH具有促进肝功能，保护肝细胞膜，提高肝脏酶的活性，加快黄疸的消退，增强肝脏解毒等功能。（2）治疗肿瘤，减轻化疗和放疗的副作用GSH能激活多种酶(如巯基-SH酶)，从而促进糖、脂肪和蛋白质代谢，并影响细胞的代谢过程，同时通过巯基与体内自由基结合，可以转化成容易代谢的酸类物质，从而加速了放化疗产生的自由基的排泄。（3）治疗眼科疾病，特别是应用于白内障的治疗GSH高浓度存在于眼组织的水晶体、视网膜及睫状体内，有益于角膜或水晶体透明性的维持以及组织再生与修复。（4）解除中毒，减轻空气污染和食物中的有毒成分对人体造成的伤害GSH能与进入机体的有毒化合物、重金属离子等直接结合，并促其排出体外，起到中和解毒的作用。（5）其他功能GSH具有较强的抗氧化作用，广泛应用于食品和保健品行业；还具有增强免疫力、治疗糖尿病神经损害、抗炎等作用。1.3国内技术现状谷胱甘肽生产方法有：萃取法、发酵法、酶法及化学合成法。化学合成得率比较低，而且污染严重。酶法近几年有报道，但目前还没有工业化报告。发酵法生产GSH所用菌种中最为常见的是酿酒酵母菌。1938年酵母制GSH最早专利诞生后数十年来不断改进和提高，目前发酵法已成为主要方法。无锡轻工业大学、华东理工大学、复旦大学已开展研究开发。无锡轻工业大学使用重组大肠杆菌；华东理工大学选育重组大肠杆菌；中国医科大用酶法制备；浙江大学以双水相分配结合温度诱导相分离；华东理工大学以明胶包埋固定化细胞。一般酵母菌体含GSH量0.4～1.2%。国内总体菌株选育水平较低，一般在1.0-1.8%之间。谷胱甘肽的总产量在600-880mg/L左右，和国外水平（2300mg/L）相差较大。北京化工大学自1999年开始研究发酵法生产谷胱甘肽，承担国家863项目“发酵法生产谷胱甘肽”。已选育得到了谷胱甘肽高产菌株，采集230株菌株，用快中子结合紫外线诱变法，得到谷胱甘肽高含量假丝酵母，谷胱甘肽含量达2.4％，特别是采用先进的酵母发酵技术，谷胱甘肽发酵水平达到2000mg/L。该菌株水平为国内领先水平。而且开发了谷胱甘肽分离纯化工艺，提取率达76%，GSH含量在98%以上。2发酵法生产谷胱甘肽自1938年实现了由酵母制备GSH以来，发酵法生产GSH的工艺方法不断得到改进，且发酵使用的细菌或酵母容易培养，原料容易获得，条件容易控制，因此发酵法已成为目前生产GSH最普遍的方法。发酵生产GSH的流程为：诱变剂→酵母→高产酵母→热水抽提→离心→调PH值→树脂吸附→酸洗脱→新鲜的CuO沉淀→离心沉淀物→H2S置换→离心过滤→浓缩→脱色→喷雾干燥→成品2.1生产菌株的选育发酵法生产GSH所用菌种中最为常见的是酵母菌，但酵母细胞的GSH含量较低，存在酵母用量大，收率低等缺点。为此人们采用物理或化学方法使出发菌株发生变异，然后在特定的培养基中进行筛选培养，使GSH在这种变异菌株的细胞内大量积累，达到高产目的；或是通过遗传工程的办法对GSH合成代谢途径进行定向修饰，提高GSH的产量。2.1.1诱变育种到目前为止，针对GSH生产的酵母菌株而进行的物理或化学的处理方法大致有紫外线、X射线、C射线以及亚硝基胍等，而培养基中的特定筛选物质(筛子)主要包括蛋氨酸、L-乙硫氨酸、DL-乙硫氨酸、1,2,4-三氮唑、氰化钠、亚硫酸盐、酰胺和靛酚等。通过一系列对菌株的改良及选育工作，获得了很多GSH高产菌株。2.1.2基因工程育种在GSH的生物合成中，GSH合成酶系的活性普遍较低，并且GSHI是一个限速酶，其活性受到GSH的反馈抑制。因此，为了减轻GSH对GSHI的反馈抑制，需要提高酶系的活力，或降低酶系对GSH的敏感性。由于谷胱甘肽合成酶系是由GSHI和GSHII两个合成酶共同组成的，所以，当GSHI的活性提高以后，GSHII就成了GSH生物合成的限速酶。Gushima等构建了含GSHI或GSHII的重组质粒并转化入E.coli细胞，结果表明，只有同时带有GSHI和GSHII基因的重组细胞才表现出最高的GSH合成活性，其中提高GSHI的活性比GSHII更加重要。傅瑞燕等将从大肠杆菌获得的编码C-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的基因克隆到质粒pNZ8148中，电转化乳酸乳球菌NZ9000，获得重组菌胞内谷胱甘肽，含量达到358nmol/mg(蛋白)。尧辉等将克隆GSHI、GSHII构建成双顺反子重组表达载体pTrc99A/GSHIGSHII，建立GSHI、GSHII蛋白表达体系。以0.08mmol/LIPTG于28℃诱导工程菌E.coliBL21，谷胱甘肽合成能力达到湿菌体8.5mg/g。2.2发酵工艺的优化生产GSH所用菌株通常能在很广的培养条件下生长并积累GSH，但产量很低。因此，要想进一步提高GSH的合成能力，除选育优良菌株外还必须对培养基中的各种营养成分及培养条件进行优化，以实现目标产物的大幅度积累。詹谷宇等在酵母菌的诱变育种中用GSH的代谢类似物乙硫氨酸作为抗性筛选物，筛得抗代谢类似物突变株K11UE126，其胞内累计GSH的量较出发菌株高出49.7%.Kimura等人采用亚硝基胍和紫外线诱变大肠杆菌B355，获得高产GSH的优良突变株，每克湿细胞含2.43mgGSH2.2.1培养基的优化卫功元等[11]研究了不同碳氮源对C.utilisWSH02-08发酵生产GSH的影响，结果表明蔗糖有利于促进细胞生长，葡萄糖对GSH的合成有极大的促进作用；单一氮源对细胞生长和GSH产量明显优于有机氮源，混合无机氮源对GSH的产量有显著的促进作用，而无机氮源对谷胱甘肽的合成影响不大。一些无机离子(如Mg2+)也是微生物发酵生产GSH必不可少的因子，微生物在缺乏Mg2+的情况下不能合成GSH，但若Mg2+过量，就抑制微生物合成GSH。此外，培养基中添加L-半胱氨酸或与谷氨酸、甘氨酸的混合物能提高细胞内GSH的含量，以添加半胱氨酸的效果最显著，但对细胞生长有一定抑制作用。2.2.2培养条件的优化环境条件也是发酵法生产谷胱甘肽不容忽视的重要因素，其中影响细胞中GSH含量的环境参数主要包括温度、溶解氧、pH等。（1）温度温度直接影响代谢过程中各种酶的活性，代谢反应速率，菌体生长量，较高温度可以降低底物对菌体生长的抑制，有利于细胞的生长，而低温更有利于谷胱甘肽的生物合成。因此，培养过程中多采用温度分阶段培养策略，即前期控制37℃左右培养菌体，后期降低温度增加酶的生物合成。（2）溶氧氧气浓度对细胞生长和GSH合成有显著影响，一方面影响着微生物的生长，另一方面对合成GSH的速率有促进作用。卫功元等研究了发酵罐中溶氧对产朊假丝酵母对分批发酵生产GSH的影响，当葡萄糖浓度为30g/L，且通气量控制在5L/min时，搅拌转速达到300r/min即可满足细胞生长和谷胱甘肽合成对溶解氧的需求。（3）pH值发酵液中的pH对营养物质的解离状态、酶活性、代谢速率有着重要的影响，因此pH也是制约GSH生产的一个关键因素。多数试验已经表明，当pH值控制在5.5时，谷胱甘肽的总产量达到最高。2.3发酵过程的控制2.3.1葡萄糖的流加策略GSH的生成与发酵液中葡萄糖的消耗密切相关。研究发现，只有在葡萄糖几乎耗尽、生长停止时，细胞内才开始大量合成GSH；且由于GSH是胞内产物，所以在提高生产菌株胞内合成GSH能力的同时，还需要在发酵过程中设法提高细胞数，以提高GSH的总产量。[7]为实现这一目标，必须加大底物(如葡萄糖)的质量浓度。但过高的葡萄糖浓度会产生Crabtree效应，抑制细胞的生长并且目标产物得率会大大下降，因此，一般采用后期限量流加葡萄糖的方法，以消除底物抑制，达到高密度细胞培养、延长GSH生产时间的目的。2.3.2前体物质的添加在前体氨基酸中，半胱氨酸为GSH合成的关键氨基酸，它的存在能明显提高细胞内GSH含量及GSH的比生产速率，但阻碍细胞量的增加。在发酵过程中半胱氨酸的补加策略应以尽量减少对生长的抑制为原则，一般有连续流加和定时补充两种方式。而实验结果表明，连续流加半胱氨酸对整个发酵过程中胞内GSH含量没有显著提高，而一次性添加半胱氨酸可以大大提高GSH比生产速率。3基因工程菌在谷胱甘肽生产中的应用在GSH的生物合成中,GSH合成酶系的活性普遍较低,并且GSHⅠ是一个限速酶,其活性受到GSH的反馈抑制.因此,为了减轻GSH对GSHⅠ的反馈抑制,需要提高酶系的活力或降低酶系对GSH的敏感性.Murata等人早期成功构建了具有较强GSH合成能力的重组E.coli并从E.coliB中筛选得到一株GSHⅠ脱敏突变株,克隆了其gshⅠ基因并在E.coliBRC912中得以表达,获得的菌株合成GSH的能力大大提高.GSHⅠ的活性提高以后,GSHⅡ就成了GSH生物合成的限速酶.Gushima等构建了含gshⅠ或gshⅡ的重组质粒并转化入E.coli细胞,结果表明只有同时带有gshⅠ和gshⅡ基因的重组细胞才表现出最高的GSH合成活性.由于酵母菌中的糖降解酶活性较高,因此可以将gshⅠ和(或)gshⅡ基因转化进入酵母细胞内以获得高产GSH的重组菌株.Ohtake等尝试在酵母中表达E.coliB的gshⅠ基因,将gshⅠ基因的全部编码片段与S.cerevisiae98的一个启动子融合,结果转化体的GSHⅠ活性和GSH的胞内含量分别提高了100多倍和3倍多.Christine和Ulf将含有E.coli中gshⅠ和gshⅡ基因的质粒pINEⅢ转化到S.cerevisiae中,明显提高了酵母合成GSH的能力,GSH在胞内的积累质量分数达到1.8%.在基因工程菌生产目的产物的过程中,必须虑菌株所带质粒的稳定性问题,而质粒的稳定性受到宿主细胞遗传特性、质粒拷贝数以及质粒上基因的表达等多种因素的影响.为此,李