化学微生物学第4章营养与培养

第四章微生物的营养与培养微生物的特点：食谱广、胃口大本章内容：一微生物的营养要求（微生物们需要吃什么？）三微生物的培养技术（如何让微生物们）生长繁殖）二培养基（如何给微生物们做饭）主要内容1.微生物的营养要求1.1微生物细胞的化学组成1.2营养物质及其生理功能1.3微生物的营养类型(nutritionaltypes)2.培养基2.1选用和设计培养基的原则和方法2.2培养基的类型及应用3.微生物的培养技术一、微生物的营养要求微生物营养是微生物生理学重要部分，主要阐明营养物质在其生命活动中的生理功能及微生物细胞从外界环境摄取营养物的具体机制。营养物质：那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质。营养：微生物获取和利用营养物质的过程。营养物质是微生物生存的物质基础，而营养是生物维持和延续其生命形式的一种生理过程。一、微生物的营养要求主要元素：C、H、O、N、S、P(97％)1.化学元素微量元素:Zn、Mn、Na、Cl、Co、Cu化学元素比例因菌种、培养条件等有所不同，如：幼龄菌含N高，硫细菌较多S，铁细菌较多Fe，等。（一）微生物细胞的化学组成一、微生物的营养要求2.化学成分及其分析化学元素组成有机物、无机物和水（70％－90％）有机物分析:1）化学法直接抽提，定性定量分析2）破碎细胞得亚显微结构，再分析（一）微生物细胞的化学组成一、微生物的营养要求无机物指与有机物或单独存在的无机盐等物质分析：干细胞高温炉（550℃）焚烧得到的灰分（ashcostituent）无机方法分析其中各种无机元素含量。水分：细胞表面水分吸干后的重量为湿重；采用低温真空干燥、红外快速烘干方法烘干至恒重为干重。（一）微生物细胞的化学组成微生物细胞元素组成1.碳源carbonsource凡是能被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。生理功能提供C元素提供能量碳源物质有机碳化物无机碳化物（二）营养物质及其生理功能微生物的碳源谱类型元素水平化合物水平培养基原料水平有机碳C·H·O·N·X复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、蛋白胨、豆饼粉等C·H·O·N多数氨基酸、简单蛋白质等一般氨基酸、明胶等C·H·O糖、有机酸、醇、脂类等葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、糖蜜等C·H烃类天然气、石油及其不同馏分、石蜡油等无机碳C(?)------C·OC02CO2C·O·N·NaCO3、CaCO3等NaCO3、CaCO3、白垩等工业发酵一般用糖蜜、淀粉、饴糖等，为节约采用纤维素这种广泛存在的物质培养微生物。不同菌种利用碳源能力不同，如：假单孢菌属中的一些能利用90多种碳源；甲基营养型只利用甲醇、甲烷等一碳化合物为能源物质。2.氮源nitrogensource凡是能被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质称为氮源是构成细胞中核酸和蛋白质的重要元素，只为少数细菌提供能量氮源的种类无机氮、有机氮、气体氮合成含氮物质，一般不作为能源，只有少数自养型利用铵盐、硝酸盐作为氮源和能源。可利用的氮源：Pr及其降解物、铵盐、硝酸盐、N2、嘌呤等。常用的Pr类氮源有：蛋白胨、鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、酵母膏等。对pr氮源利用选择性：玉米浆是速效氮源，利于菌体生长；花生饼粉和黄豆饼粉是迟效氮源，利于代谢产物积累。2.氮源（Sourceofnitrogen）微生物的氮源谱类型元素水平化合物水平培养基原料水平有机氮N·C·H·O·X复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、酵母膏、豆饼粉、蚕蛹等N·C·H·O尿素、多数氨基酸、简单蛋白质等尿素、蛋白胨、明胶等无机氮N·HNH3、铵盐等（NH4）2SO4等N·O硝酸盐等KNO3等NN2空气部分发酵产物的氮源功能：酶活性中心的组成部分，维持生物大分子和细胞结构稳定性、调节渗透压、控制氧化还原电位、某些生物能源等。3.无机盐（inorganicsalt）无机盐的功能大量（主要/宏量）元素macroelementsP、S、K、Na、Ca、Mg等需要量：10-3~10-4M微量元素microelementsFe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo等需要量：10-6~10-8M无机盐一般采用的浓度范围对一些产物有影响的微量元素4.生长因子growthfactor生长因子是指微生物生长不可缺少的微量有机物质。种类维生素、氨基酸、碱基需要量维生素：1—50ug/L氨基酸：20—50ug/L碱基：10—20ug/L核苷或核苷酸：200—2000ug/L几种微生物的生长因子菌种生长因子丙酮丁醇梭菌对氨基苯甲酸德氏乳杆菌酪氨酸、胸腺核苷干酪乳杆菌生物素、麻黄素粪链球菌叶酸、精氨酸肠膜明串珠菌吡哆醛金黄色葡萄球菌硫胺素向培养基中添加生长因子的措施直接添加添加富含生长因子的物质酵母膏，玉米浆，肝浸汁，麦芽汁玉米浆含的氨基酸5.水1）溶剂和运输介质，营养物质吸收及代谢物分泌2）参与细胞内的生化反应3）维持Pr、核酸稳定天然构象4）热的良好导体，控制细胞内温度变化5）维持细胞自身正常形态6）控制酶、微管、鞭毛等多亚基结构组装和解离几种生物的游离水含量人：~60%海蛰：~96%微生物：孢子：霉菌孢子：~39%细菌芽孢：皮层：~70%核心：极低营养体：细菌：~80%酵母：~75%霉菌：~85%水活度值（αw）：一定温度、压力下溶液蒸汽压力与同样条件下纯水压力比。微生物一般在0.60～0.99生长，αw过低微生物生长的延缓期延长，比生长速率和总生长量减少。一般细菌的比酵母和霉菌高，嗜盐菌较低0.76。（三）微生物的营养类型(nutritionaltypes)微生物营养类型的分类标准：生长所需要的营养物质（碳源）自养型：以CO2为唯一或主要碳源异养型：以有机物为主要碳源生长过程中能量的来源（能源）光能型：生长所需的能量来自于光源化能型：生长所需的能量来自于有机物氧化释放的化学能光能自养型：以光为能源，不依赖任何有机物即可正常生长光能异养型：以光为能源，但生长需要一定的有机营养化能自养型：以无机物的氧化获得能量，生长不依赖有机营养物化能异养型：以有机物的氧化获得能量，生长依赖于有机营养物质划分依据营养类型特点碳源自养型以CO2为唯一或主要碳源异养型有机物能源光能营养型光为能源化能营养型有机物氧化的化学能电子供体无机营养型还原无机物为e供体有机营养型有机物为e供体微生物营养类型(Ⅰ)（三）微生物的营养类型微生物的营养类型(Ⅱ)营养类型电子供体碳源能源举例光能无机自养型（光能自养型）H2、H2S、S或H2OCO2光能着色细菌、蓝细菌、藻类光能有机异养型（光能异养型）有机物有机物光能红螺细菌化能无机自养型（化能自养型）H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2-CO2化学能(无机物氧化)氢细菌、硫杆菌、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)化能有机异养型（化能异养型）有机物有机物化学能（有机物氧化)假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳酸菌属、真菌、原生动物据供氢体无机型：通过氧化无机物来还原CO2进行细胞生长有机型：以有机物为供氢体来部分还原CO2进行细胞生长1．光能无机自养型（光能自养型）能以CO2为主要唯一或主要碳源；进行光合作用获取生长所需要的能量；以无机物如H2、H2S、S等作为供氢体或电子供体，使CO2还原为细胞物质；例如，藻类及蓝细菌等和植物一样，以水为电子供体（供氢体），进行产氧型的光合作用，合成细胞物质。而红硫细菌，以H2S为电子供体，产生细胞物质，并伴随硫元素的产生。CO2+2H2S光能光合色素[CH2O]+2S+H2O2．光能有机异养型（光能异养型）微生物不能以CO2为主要或唯一的碳源；以有机物作为供氢体，利用光能将CO2还原为细胞物质；在生长时大多数需要外源的生长因子；例如，红螺菌属中的一些细菌能利用异丙醇作为供氢体，将CO2还原成细胞物质，同时积累丙酮。CHOH+CO2H3CH3C2光能光合色素2CH3C0CH3+[CH2O]+H2O4．化能有机异养型（化能异养型）微生物生长所需要的能量均来自有机物氧化过程中放出的化学能；生长所需要的碳源主要是一些有机化合物，如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等。有机物通常既是碳源也是能源；大多数细菌、真菌、原生动物都是化能有机异养型微生物；所有致病微生物均为化能有机异养型微生物；4．化能有机异养型（化能异养型）微生物腐生型(metatrophy)：可利用无生命的有机物(如动植物尸体和残体)作为碳源；寄生型(paratrophy)：寄生在活的寄主机体内吸取营养物质,离开寄主就不能生存；在腐生型和寄生型之间还存在中间类型：兼性腐生型(facultivemetatrophy)；兼性寄生型(facultiveparatrophy)；根据它们所用的有机物的特性，将其又分为如下两类不同营养类型之间的界限并非绝对：异养型微生物并非绝对不能利用CO2；自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长；有些微生物在不同生长条件下生长时,其营养类型也会发生改变；例如紫色非硫细菌(purplenonsulphurbacteria)：没有有机物时，同化CO2，为自养型微生物；有机物存在时，利用有机物进行生长，为异养型微生物；光照和厌氧条件下，利用光能生长，为光能营养型微生物；黑暗与好氧条件下，依靠有机物氧化产生的化学能生长，为化能营养型微生物；微生物营养类型的可变性无疑有利于提高其对环境条件变化的适应能力微生物营养类型不是一成不变的，在一定条件下会转化的。例如紫色非硫细菌(purplenonsulphurbacteria)：没有有机物时，同化CO2，为自养型微生物；有机物存在时，利用有机物进行生长，为异养型微生物；光照和厌氧条件下，利用光能生长，为光能营养型微生物；黑暗与好氧条件下，依靠有机物氧化产生的化学能生长，为化能营养型微生物；营养缺陷型：突变后失去合成某种对该菌株必不可少的物质的能力，为营养缺陷型原养型：相应的野生型为原养型二培养基培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；常规高压蒸汽灭菌：1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟某些成分进行分别灭菌；过滤除菌；一、配制培养基的原则2、营养物质浓度及配比合适营养物质的浓度适宜；营养物质之间的配比适宜；高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。发酵生产谷氨酸时：碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。细菌一般肉汤培养基；放线菌高氏1号合成培养基；酵母菌麦芽汁培养基一、配制培养基的原则3、物理化学条件适宜pH；水活度；氧化还原电位；3、物理化学条件适宜1）pH培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。通常培养条件：细菌与放线菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范围内生长为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。在微生物生长过程中会有变化，所以需要加缓冲剂，最常见的是磷酸盐缓冲剂(6.4~7.2)若是大量产酸可加入难溶的碳酸盐中和。aa、肽、蛋白两性电解质也有缓冲作用。3、物理化学条件适宜2）水活度在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量，一般用在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸汽压力与同样条件下纯水蒸汽压力之比表示，即：αw=Pw/Pow式中Pw代表溶液蒸汽压力,POw代表纯水蒸汽压力。纯水αw为1.00,溶液中溶质越多,αw越小。微生物一般在αw为0.60～0.99的条件下