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尊敬的《中国微生态学杂志》编辑：“金黄色葡萄球菌的耐药性分析及基因分型研究”一文是由鲍宏达等撰写的论著。该文通过实验分析了上海某大型医院的院内分离菌株的耐药谱和基因型，并研究了菌株的亲缘关系，对防治强致病多耐药型金黄色葡萄球菌在该院的流行提出了有针对性的意见和建议。敬请各位编辑给予指正，谢谢！文章第一作者：鲍宏达，男，1987年生，研究方向：分子流行病学通讯作者：刘畅，Email:[e-mail]我们保证该文章从未在任何公开杂志发表，也绝对没有一稿多投。金黄色葡萄球菌的耐药性分析及基因分型研究鲍宏达徐白莹刘畅韩立中倪语星郭晓奎（上海交通大学医学院上海200025）[摘要]目的通过分析上海地区院内分离金黄色葡萄球菌的药敏谱型及对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）进行基因谱型的研究，了解金黄色葡萄球菌的院内流行状况。方法对临床分离出的43株金黄色葡萄球菌进行药敏试验和SCCmec基因盒的多重PCR检测，并将结果整合后用MEGA3.1软件分析其进化相关关系。结果药敏结果显示43株金葡菌对青霉素和甲氧西林的耐药率最高。甲氧西林的耐药率达到62.8％。MecA阳性菌株SCCmec的分型显示均为II型或III型，且所占比例相近，未见I型和IV型。进化树分析发现了在同一医院中亲缘关系相近的菌株，为院内感染流行株。结论MecA基因介导的MRSA在分离菌株中所占比例高，存在院内感染爆发性流行。[关键词]耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、基因谱型、多重PCR、耐药性、院内感染Typingandphylogenyanalysisofmethcillin-resistantStaphylococcusaureusinnosocomialinfections.Hong-daBAO，Bai-yingXU，ChangLiu，Li-zhongHan,Yu-xingNi,Xiao-kuiGuo(ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai,200025China)[Abstract]ObjectiveTodeterminetheantimicrobialsusceptibilityandmoleculartypesamongclinicalisolatesofMethcillin-resistantStaphylococcusaureusfromdifferentdepartmentsinShanghaiRuijinhospital,andevaluatetheprevalenceofStaphylococcusaureusinnosocomialinfections(NI).MethodsAntimicrobialsusceptibilityofforty-threestrainsisolatedfrompatientswereexaminedbydiscdiffusionmethod;methicillin-resistantstrainswithmecAgeneweretypedbymultiplexPCRmethod.MEGA3.1softwarewasappliedtoanalyzethehomologyofthestrainsaccordingtothesusceptibilitytestsandthegenetypingmethods.ResultsTheratesoftheresistancetopenicillinandmethcillinisthehighest,especiallytheresistantmethcillinisupto62.8%.SCCmectypingmethodgavetheresultthatonlytypeIIandtypeIIIstrainswerediscovered,noneofthetypeIandtypeIVwerefound.Relativeanalysisshowedphylogenyhomologousstrainsexist.ConclusionPrevalenceofcertaintypesofmecApositiveMRSAstrainsleadingtoepidemicoutbreak.[KeyWords]Methcillin-resistantStaphylococcusaureus;Genotype;multiplexPCR;antibioticresistance；nosocomialinfections金黄色葡萄球菌（Staphlococcusaureus），简称金葡菌，是引起院内感染的重要革兰阳性病原菌之一。近年来，随着抗生素的广泛使用，其耐药现象日益严重，导致临床诊断和用药困难，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methcillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)引起的院内感染(nosocomialinfection)已经成为全世界严重的公共卫生问题。建立快速、可靠的检测和分型方法，对于相关卫生部门控制耐药菌株的流行具有非常重要的意义。MRSA的产生多数是由于获得了可转移性耐药基因mecA，在mecA阳性的MRSA菌株复制起始点附近有一特征性结构，此结构内含有mecA基因，并可在以整体形式在不同菌株间相互传播，称为葡萄球菌染色体盒mec（(staphylococcalchromosomecassette，SCCmec）。对SCCmec进行基因分型是一种重要的MRSA的分型方法，目前国际上研究主要可将MRSA分为五种型别[1-3]，对于MRSA的流行病学研究具有重要意义。本研究对上海瑞金医院2007年7-8月临床分离的43株S.aureus进行药敏分型和SCCmec分型，并整合两种分型方法分析了菌株间的亲缘关系，旨在对感染菌株的耐药特点和流行病学特征有所了解。1材料与方法1.1.菌株来源2007年7-8月上海交通大学医学院附属瑞金医院临床检验科收集的住院患者送检标本（包括痰、咽拭子、尿、创面或伤口分泌物、血）中分离的医院感染菌株43株。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923，来自本教研室。1.2细菌鉴定所有分离菌株经全自动细菌鉴定仪（法国梅里埃）APIStaph系统进行生化鉴定。1.3培养基和药敏纸片MH琼脂干粉培养基购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司。所用的药敏纸片包括庆大霉素(GM)、青霉素（P）、甲氧西林（MET）、优立新（SAM）、头孢唑啉（CZ）、万古霉素（VA）、四环素（T）、克林霉素（CL）、复方新诺明（SXT）、磷霉素（FM）、利福平（RA）、替考拉宁（TP）、左氧沙星（LVF）。均购自美国BD公司。1.4药敏试验采用K-B法测定43株菌对13种抗生素药物的药物敏感性，结果依据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）2004年版进行判读。结果分别标记为敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。1.5细菌DNA的制备选择对甲氧西林耐药的菌株，吸取1.5mL的过夜培养菌液置于Eppendorf管中，离心沉淀后用小量细菌基因组抽提试剂盒（华舜）抽提细菌基因组DNA作为模板，按照试剂盒的说明书操作。1.6基因分型根据Genebank上mecA的基因序列设计引物mecA1和mecA2，从耐甲氧西林的菌株中筛选mecA阳性的样本。然后采用多重PCR的方法，设计针对SCCmecI型至IV型的6对引物，进行葡萄球菌染色体盒分型（SCCmec）。各种靶基因引物序列和产物长度列于表1。PCR扩增条件均为：25μL反应体系，2×TaqMasterMix(北京天根生化科技有限公司)12.5μL，上下游引物各1μL、模板1μL，用ddH2O补至25μL。在BIORADPCR扩增仪上设置扩增条件如下：95℃预变性4min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共循环30次，最终72℃延伸4min。扩增产物取10ul进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。PCR产物表现出495bp和342bp的为I型，表现出342bp，284bp和209bp的为II型，表现出414bp，243bp和209bp的为III型，只有一条342bp的是IV型。表1靶基因PCR引物序列[4]基因名称引物名称引物序列产物长度CIFCIF2F2TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG495CIF2R2ATTTACCACAAGGACTACCAGCKDPKDPF1AATCATCTGCCATTGGTGATGC284KDPR1CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGGMECMECIP2ATCAAGACTTGCATTCAGGC209MECIP3GCGGTTTCAATTCACTTGTCRIF4RIF4F3GTGATTGTTCGAGATATGTGG243RIF4R9CGCTTTATCTGTATCTATCGCRIF5RIF5F10TTCTTAAGTACACGCTGAATCG414RIF5R13GTCACAGTAATTCCATCAATGCDCSDCSF2CATCCTATGATAGCTTGGTC342DCSR1CTAAATCATAGCCATGACCGmecAMecA1GTTGTAGTTGTCGGGTTTG446MecA2TCCACATTGTTTCGGTCT1.7整合药敏试验和SCCmec分型结果，对mecA阳性的菌株用MEGA3.1软件进行菌株亲缘关系比较，并构建进化树。2结果2.1细菌鉴定经全自动细菌鉴定仪鉴定，43株菌属于金黄色葡萄球菌种。2.1药敏试验43株金黄色葡萄球菌中有27株菌对甲氧西林耐药，MRSA菌株占到62.8％。所以菌株对其它12种抗生素的药敏试验结果见表2,从表中可以看出，43株菌对青霉素的耐药率最高，达到90.7％，对替考拉宁的耐药率最低，仅2.3％。无万古霉素耐药菌株。表243株金黄色葡萄球菌对13种药物的耐药性抗菌药物MRSA(n=27)MSSA(n=16)总耐药率(%)庆大霉素青霉素优立新头孢唑啉万古霉素四环素克林霉素复方新诺明磷霉素利福平替考拉宁左氧沙星81.5（22/27）100（27/27）85.2（23/27）92.6（25/27）0（0/27）88.9（24/27）88.9（24/27）33.3（9/27）14.8（4/27）44.4（12/27）3.7（1/27）74（20/27）12.5（2/16）75（12/16）6.3（1/16）0（0/0）0（0/16）18.8（3/16）6.3（1/16）0（0/16）6.3（1/16）0（0/16）0（0/16）0（0/16）55.8（24/43）90.7（29/43）55.8（24/43）58.1（25/43）0（0/43）62.8（27/43）58.1（25/43）20.9（9/43）11.6（5/43）25.6（12/43）2.3（1/43）46.5（20/43）2.2SCCmec分型结果43株菌中对甲氧西林耐药的共有27株。经筛查，mecA阳性的菌株为24株，占到88.9％。SCCmec分型结果提示，在所有mecA阳性的菌株中，可检测出II型菌株9株，占37.5％；III型菌株15株，占62.5％。未见I型和IV型菌株的存在。2.3整合后的菌株亲缘关系比较结果将mecA阳性的24株菌结合药敏试验的分型结果，用MEGA3.1软件分析其同源性，构建进化树结果见图1。3讨论金黄色葡萄球菌是引起医院和社区感染的重要致病菌，随着抗生素的广泛应用和各种侵入性医疗装置的应用，临床上耐药菌株不断增多，尤其是MRSA引起的院内感染，可引起爆发性流行，并可远距离播散。对院内感染的MRSA菌株进行耐药谱分析和基因分型对于控制MRSA的院内传播和爆发具有重要的流行病学意义。细菌分型的前提是流行病学上相关的菌株源于单一亲代的克隆扩增，分型方法有生物型、药敏谱型、血清型和噬菌体型等表型方法和质粒分析、染色体DNA限制性内切酶分析、Southern杂交、PFGE、PCR分析等基因方法两大类。药敏谱型是细菌耐药性检测方面无可替代，并