副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

1副猪嗜血杆菌的分离与鉴定李晓华*杨小燕郑新添戴爱玲李改娜（福建龙岩学院生命科学学院预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心福建龙岩364000）摘要：从福建省龙岩市l例临床症状、病理剖检变化疑似副猪嗜血杆菌病的患病猪的关节液中分离到1株革兰氏染色阴性可疑菌株，经卫星现象、生化鉴定等实验室诊断，进一步以副猪嗜血杆菌的16SrRNA基因设计特异性引物进行PCR鉴定，确定该分离菌为副猪嗜血杆菌。药敏试验结果表明，分离株对环丙沙星、氨苄西林、阿米卡星、庆大霉素、氟苯尼考、磺胺类等药物敏感；对阿莫西林、诺氟沙星有抵抗力。关键词：副嗜血杆菌；分离鉴定；药敏试验IsolationandIdentificationofHaemophilusparasuisXiaohua-Lixiaoyan-Yangxintian-Zhengailing-Daigaina-Li1.CollegeofLifeSciences,LongyanUniversity,Longyan,FujianProvince364000,PRChina2.KeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicineandBiotechnology,LongyanUniversity,Longyan,FujianProvince364000,PRChina3.EngineeringResearchCenterforthePreventionandControlofZoonosis，FujianProvince364000,PRChinaAbstract：AcoveyofswinewhoseclinicalsymptomslookedlikeHaemophilusparasuisdiseasewerecheckedbylabtechnologies．Researchasbacteriaobservation，culturalcharacteristicsandbiochemicalpropertiesofHaemophilusparasuisweredone．Accordingtothesequenceofbacteriuml6SrRNA，specialprimersweredesignedforPCRamplification.TheresultsshowedthatthestrainwastentativelyidentifiedasHaemophilusparasuis．Thedrugsensitivetestsshowed：thestrainwassensitiveto环丙沙星、氨苄西林、阿米卡星、庆大霉素、氟苯尼考、磺胺类等药物敏感；对阿莫西林、诺氟沙星．Keywords：Haemophilusparasuis；isolationandidentification;drugsensitivetest——————李晓华(1968、8—),女,福建长汀人，高级实验师，主要从事实验室管理及动物疫病防控研究。基金项目：福建省科技厅创新平台建设项目（FJ200812）福建省科技计划项目（2008N2005）*通讯作者2猪副嗜血杆菌病(Haemophilusparasuis，Hps)又称“革拉瑟氏病”(Gllisser’sDisease)，是由副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)引起的一种以多发性浆膜炎和关节炎为特征的疾病[1]。该菌寄生在健康猪鼻腔等上呼吸道内，主要通过空气直接接触传播，其他传播途径如消化道等亦可传播[2]。主要影响2～4周龄的猪，感染高峰为4～6周龄的猪[3]，发病率在10%～15%，严重时病死率可达50%。随着规模化养殖和养殖密度的增加，近年来，该病的发病率和死亡率均呈上升趋势，成为危害规模化养猪场最严重的细菌性疾病之一，给养猪业造成巨大的经济损失。2008年10月，福建龙岩某规模化猪场5—8周龄的保育猪发病严重,临床症状主要表现为精神沉郁、食欲减少，体温升高40-41℃,流鼻涕,腹式呼吸,被毛粗乱，消瘦、关节肿大，病猪不愿站立，跛行，病程达4个多月，发病率40%。剖检病变主要表现为体内有水肿、充血、血液不凝,呈暗红色,全身脏器多数有出血斑点,膀胱粘膜和肾皮质点状出血,喉、会咽斑状出血,胸腔内有大量淡红色液体、纤维性渗出物;心包有大量纤维素性渗出物，似菜花状；肺脏呈纤维素性胸膜肺炎,腹腔内有大量透明黄褐色渗出液；关节腔内充满黄色浑浊液。怀疑猪副嗜血杆菌感染而致，随机采集病料进行病原分离鉴定及药敏试验。1材料与方法1.1材料1.1.1病料采自福建省龙岩市某猪场疑似Hps发病仔猪的肺脏、心血、关节积液、心包液、气管。1.1.2培养基普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基由实验室配制、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基购于青岛海博公司；0.005%NAD巧克力琼脂培养基、SS培养基、麦康凯培养基购于北京陆桥技术有限责任公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）购于成都贝斯特试剂有限公司1.1.3生化微量鉴定管H2S、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇、尿素酶、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、D-核糖、葡萄糖酸、柠檬酸盐均购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.4药敏试纸：强力霉素、阿莫西林、磺胺-6-甲氧嘧啶、环丙沙星、氨苄西林、头孢噻呋钠、阿米卡星、恩诺沙星、诺氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、氟苯尼考、复方治菌磺、林可大观、磺胺间甲氧嘧啶、泰妙菌素、泰乐菌素等药敏纸片由实验室自制。1.1.5PCR反应试剂：如TaqDNA聚合酶(5IU/μL)、蛋白酶K、dNTPs，均由宝生物(大连)有限公司提供，-20℃保存。1.1.6引物设计与合成参照SimoneOliveira等[9]的报道合成引物：上游引物P1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′,下游引物P2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，预扩增片段大小为821bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.2方法1.2．1细菌的分离培养无菌取送检的疑似患病猪的肺脏、心血、心包液、气管和关节积液，划线接种于巧克力培养基和5%新生牛血清TSA培养基,置于37℃恒温培养箱中，烛缸培养24-48h，观察结果。1.2.2细菌形态及生化特性检查1.2.2.1细菌形态学检查挑取TSA平板上生长的疑似菌落涂片，革兰氏染色镜检，观察细菌的形态特征。1．2.2.2细菌培养特性挑取TSA平板上生长的单菌落，分别接种于含0.005%NAD的兔鲜血琼脂培养基平板、5%新生牛血清TSA培养基平板、鲜血琼脂培养基平板、巧克力琼脂培养基平板、麦康凯培养基和普通培养基平板中，置于37℃恒温培养箱中，烛缸培养24-48h。观察细菌的生长3情况。1.2.3卫星试验在两个不含V因子的兔鲜血琼脂平板上接种可疑菌株，一个平行划线接种两行金黄色葡萄球菌，另一个作对照。在培养箱中37℃烛缸培养48h，观察结果。1.2.4生化鉴定将分离所得可疑菌株的纯培养物分别接种于H2S、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇、尿素酶、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、D-核糖、葡萄糖酸、柠檬酸盐微量生化鉴定管中，每支生化管中同时加入1μL牛血清和1μLNAD的（V因子）置于37℃恒温培养箱，烛缸培养24-48h,观察结果。接触酶试验：挑取单菌落在一洁净的玻片上，滴加30%的过氧化氢，30s内观察反应结果。1.2.5PCR检测1.2.5.1细菌DNA的提取挑取单菌落进行亚克隆培养，用灭菌的双蒸水小心刮洗菌苔,置于1.5mL离心管中。12000rpm离心30s,弃上清，保留细胞沉淀；加入567μLTE悬浮沉淀，用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提,，使两相完全混合，冰浴10分钟。12000rpm离心10分钟，吸取上清液，等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)再抽提1次，至溶液中有絮状的DNA沉淀出现；将DNA沉淀转移到1mL70%乙醇中洗涤，65℃干燥箱中干燥2分钟。用50-100μLTE缓冲液(含20μg/mLRNase)溶解DNA沉淀，即为试验所需模板，4℃保存备用。1．2.5.2PCR鉴定以上述方法提取得到的菌株DNA为模板,将P1、P2等比例混合，PCR反应体系为50μL:10×TaqBuffer5μL,10μmol/LdNTP2μL,Template2μL,5U/μLTaqDNA聚合酶1μL,H2O36μL，上、下游引物(浓度均为10μmol／L)各1μL，反应条件为94℃5min；94℃30s,58℃30s,72℃1min,30个循环;72℃7min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。1.2.6药敏试验无菌棉签蘸取分离菌的菌悬液,涂布接种于含NAD及新生犊牛血清的TSA平板上,然后把做好的药物纸片用无菌镊子分别平贴于培养基表面,于37℃CO2培养箱中培养24h,测量抑菌环直径并判定结果。判断标准为：抑菌圈直径小于15mm的为不敏感，15～20mm的为中度敏感，20mm以上的为高度敏感。2结果2.1细菌的分离培养取关节液划线接种的巧克力培养基上出现无色、透明的小菌落,接种于普通培养基不生长。接种于TSA平板，可见有针尖大小、圆形、光滑湿润、无色透明、边缘整齐的小菌落生长。2.2细菌的形态学检查取分离所得可疑菌落涂片，革兰氏染色后在光学显微镜下见到革兰氏阴性的短杆状或球杆状小杆菌，以纤细杆状居多。2.3培养特性该菌在普通琼脂平板、麦康凯培养基中均未见生长，在鲜血琼脂平板、巧克力平板上生长不好，在TSA平板、NAD鲜血琼脂平板上生长良好。表1细菌培养特性Table1.TheCulturalCharacteristicsoftheisolatiedstrains培养基生长情况菌落形态普通培养基-麦康凯培养基-SS培养基-4鲜血琼脂培养基+极少数无色透明、边缘光滑、湿润的针尖状大小菌落，传代后几乎不生长巧克力琼脂培养基++无色透明、边缘光滑、湿润、针尖状大小的菌落，传代后几乎不生长0.005%NAD的鲜血琼脂培养基+++无色透明、边缘光滑、湿润的菌落，菌落呈针尖状大小，边缘整齐含5%新生牛血清和0.005%NADTSA培养基++++无色透明、边缘光滑、湿润的菌落，菌落呈针尖状大小，边缘整齐，大量的菌落连成一片注：“++++”生长良好；“+++”生长一般；“++”生长但生长较差；“+”生长但极难生长；“-”不长。2.4卫星现象试验观察结果可见，越接近葡萄球菌所形成的菌株，菌落越大、越多，离葡萄球菌愈远，菌落越小、越少，甚至不生长，呈现出明显的“卫星现象”。2.5生化鉴定结果分离株生化鉴定结果见表2。表2：分离菌生化鉴定结果Table2.Thebiochemistriesidentificationofisolatiedstrains项目ItemH2S蔗糖Saccharose麦芽糖Maltobiose乳糖lactose半乳糖Galactose山梨醇Sorbitolum甘露醇Manciol尿素酶urase接触酶Catalase结果Result-++----++项目Item赖氨酸lysine鸟氨酸ornithine苯丙氨酸L-Phenylalanine葡萄糖DextrosD-核糖Ribose葡萄糖酸盐gluconate柠檬酸盐citrate结果Result---+---注:“-”阴性;“+”阳性。Note:+positive,-negative.2.6PCR反应结果以提取的总DNA产物作为模板,用PCR方法扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察，发现被检菌株有约821bp的特异性条带，其大小与预期的扩增片段大小相符。如图2:图2：PCR检测结果M：DNA标准DL2000；1:分离株PCR产物；2：阴性对照Figure2.ResultsofPCRidentification10050075010002000250M12821bp5M:DNAMarkerDL2000;1:ResultsofPCRamplificatio