动物性组织或材料中盐酸克伦特罗残留量的检测

1动物性组织或材料中盐酸克伦特罗残留量的检测黄启良副研究员中国农业科学院植物保护研究所2005年6月,四川成都2黄啟良中国农业科学院植物保护研究所副研究员中国农业大学农业应用化学系农药专业博士主要从事农药剂型加工原理和农药产品质量检测方法研究联系电话：[phone]（办）13501386791E-mail:[e-mail][e-mail]31．您对盐酸克伦特罗（CLB）的了解程度是①不了解②一般了解③非常了解2.您对ELISA方法的了解程度是①不了解②一般了解③非常了解3.您承担或参加过CLB残留检测的实验吗？①是②否4.如果选择①，您所采用的实验方法是:①HPLC②GC-MS③ELISA④其他5.通过本次培训，您最想了解的是①国内外现状②方法原理③实验操作程序④其他背景知识了解4主要内容CLB(clenbuterol)ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay）CLB残留的快速ELISA检测5CLB(clenbuterol)6一、CLB概述结构式：通用名称：clenbuterol,CLB化学名称：α-[（叔丁氨基）甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐7商品名称：氨哮素、克喘素俗名：瘦肉精分子式：C12H18C12N20-HCl相对分子质量：313.658是一种选择性β2-肾上素受体激动剂（简称β-兴奋剂），白色或类似白色结晶粉末，无臭，味微苦，易溶于水、甲醇、乙醇。化学性质稳定，172℃开始分解，经260℃油煎5min才会破坏减半。口服后在胃肠吸收迅速，10-20min起效，2-3h血液浓度达到峰值，作用维持5h左右，半衰期25-39h,消除5个半衰期（约97%）需5-8d。易在动物眼睛、毛发、肝、肺、肾等组织中蓄积。理化特性：9二、CLB的药用机理早期用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛：与β受体选择性结合，使β2受体出现兴奋效应，致使平滑肌舒张、通气改善。后期用于促进动物生长、提高瘦肉率：通过肾上腺素刺激腺苷酸环化酶的合成，从而升高环磷酸腺苷的浓度，提高激素敏感酯酶活性，加快脂肪分解。10三、CLB对人、畜的危害使用剂量是治疗剂量的5-10倍持续添加时间长（一般3周以上）在动物体内消解半衰期长（25-39h）易在动物体内形成累积残留蓄积部位眼肺、肝、肾肌肉、脂肪残留（血浆中浓度倍数）10720-903-15CLB在动物组织中蓄积残留分布11给药方式给药剂量给药时间尿中残留混饲给药1.33mg/kg7d30dCLB在猪尿中的残留时间12危及人类健康的事件不断发生CLB残留引起中毒事件最早发生在西班牙:89年10月至90年7月间135人中毒，43个家庭中91%成员受到影响;92年该国北部地区又暴发232例中毒病例。90年秋季法国有8个家庭22人发生CLB中毒98年5月香港发生-激动素事件2001年我国广东发生“瘦肉精”食物中毒事件13人食用含CLB残留畜产品后的表现主要危害肝脏和肾脏,表现为肌肉兴奋性增强:肌肉震颤,心肌收缩加强,心率加快分解脂肪成游离酸进入血液:血管壁弹性降低,血压升高,头疼头晕内脏横纹肌和平滑肌兴奋性增强:呕吐和腹泻14四、CLB的检验、检疫要求检验、检疫现状1987年，欧盟、美国宣布禁止使用CLB作兽用饲料添加剂目前，欧盟成员国已将CLB残留作为肉品进口必检项目我国政府也与97年发文禁止在饲料中添加使用CLB国际奥委会也将CLB列为被查的兴奋剂名单15总体来看，是政府主导行为政府制定监测计划政府提供经费政府组织实施政府公布监测信息政府对超标样品进行处罚和调查国外检验、检疫的做法16组织部门：农业部食品安全检验署（FSIS）监控对象：肉、家禽和蛋产品中农药、兽药残留实施年限：1967年起检测机构：FSIS直属实验室和认可的实验室结果发布：年度报告监测数量：2001年，21.2万批次美国“国家残留计划（NRP）”17欧盟检测机构：合同实验室监测数量：2002年，农药残留56046批次，兽药残留70.8万批次结果发布：定期发布欧盟年度监测计划：欧盟委员会健康和消费者保护总局负责制定本国残留监测计划：各国根据欧盟年度监测计划制定协作残留监测计划：针对特殊问题（二恶英）18澳大利亚《国家残留监测计划》组织实施：农业部国家残留监测处执行单位：进口产品为农业部，国内产品为地方政府相应机构检测机构：10个合同实验室结果发布：农业部定期公布检测数量：2003-2004年度，18735批次19日本进口食品监测和指导计划组织实施：厚生省药物和食品安全署检测机构：全国32个检疫站结果发布：厚生省定期发布监测数量：2003年，72000批次国内产品监测工作地方政府相应部门承担，检测由合同实验室承担20国外检验、检疫的特点法律基础明确美国–《联邦肉检查法案(FMIA)》–《家禽产品检查法案(PPIA)》–《蛋产品检查法案(EPIA)》欧盟：欧盟理事会96／23／EC指令澳大利亚：《国家残留监测管理法》和《国家残留监控（国税/进口税征收法》日本：《食品卫生法》21国外检验、检疫的特点经费保障有力美国、日本:政府财政预算澳大利亚:特别残留监测税欧盟各成员国不尽相同：英国是征收残留监测税德国靠政府财政22国外检验、检疫的特点抽样制度科学抽样计划：完全依据于监测目的和统计学要求抽样数量：针对性、可行性、置信水平确定时间选择：常年、定期23检测高效准确国外检验、检疫的特点检测：不限定特定方法，重点为通过能力验证，保证检验质量先筛选后确证，保证检验高效经济检测机构：政府实验室与合同实验室并存美、日以政府实验室为主欧盟和澳大利亚以合同实验室为主24国外检验、检疫的特点超标结果处理得当快速通报：定期网上和文本公布制度不合格样品处理–追溯：欧盟–召回：美国–惩罚：•欧盟：建立食品和饲料快速警报体系（RASFF）对消费者有严重健康风险产品，快速通告其它成员国起诉：澳大利亚公布结果：美国FSIS加大抽样频度25国内检验、检疫的做法与特点以农业部文件来规范农产品质量例行监测行业归口进行流通领域检测一般根据经费决定抽样数量按照国家/行业标准选择检测方法一般委托行业所属专业性检验检疫机构或质量检测中心检测……26五、CLB的检验、检测方法感官识别：健康肉淡红色，肉质弹性好，无“出汗”现象；“问题肉”特别鲜红，脂肪非常薄，瘦肉纤维疏松，有“出汗”现象色谱检测技术（HPLC）：最低检测限范围为1-15ng/g，样品不必衍生；半确证法色-质联用技术（GC-MS）：最低检测限可达0.5ng/g，可同时定性、定量；确证性方法ELISA测定法：特异性强、灵敏度高、酶标板上一次可作多份样品检测；快速筛选方法27ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay）28一、ELISA概述免疫定义:机体识别和排除进入体内的抗原性异物的保护性反应，以维持机体的生理平衡和稳定。两类—非特异性免疫—特异性免疫29非特异性免疫—机体在长期种系发育和进化过程中逐渐建立起的一系列防卫功能，个体出生时就具有—不是针对某一抗原物质—受遗传因素控制，具有相对稳定性特异性免疫—个体在生活过程中，由病原微生物等抗原物质接触后所产生的免疫，又称后天获得性免疫。—特异性免疫反应是由抗原刺激，诱导抗体产生抗原抗体结合而触发的一系列反应。30抗原定义：抗原是一种大分子物质，能刺激机体的免疫系统，发生免疫反应而产生抗体。两方面属性免疫原性能刺激机体发生免疫反应，产生抗体反应原性能与相应抗体发生特异性结合31构成抗原的条件异质性:是机体的异种物质，差异越大，抗原性越强一定的理化性状:应具有稳定的、特殊化学结构或立体构象的基团----抗原决定簇特异性:与相应抗体发生反应的特异性，由抗原表面的特殊化学基团即抗原决定簇的数目和空间构型所决定32完全抗原—有免疫原性能刺激机体发生免疫反应，产生抗体—有反应原性能与相应抗体发生特异性结合—蛋白质是良好抗原，如细菌、病毒、动物血清等半抗原—只有反应原性，缺乏免疫原性—大多数农药、兽药是半抗原，与蛋白质等大分子结合后，才具有免疫原性即半抗原＋载体＝完全抗原抗原类别33抗体定义：机体在抗原性物质刺激下形成的一类可与抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。按来源分为两类天然抗体－存在于各种动物血清中－有凝集和溶解异种动物红细胞的抗体免疫抗体－机体受病原微生物等感染或接受接种而产生的抗体－人工合成的农、兽药抗原接种于动物后产生的抗体34抗体的特点抗体在动物体外仍保持其生物活性，相应抗原的结合可在体外进行结合反应是－特异性－相对稳定的、可逆的－多个分子间作用力的总和－物理的吸附反应－符合质量作用定律35酶联结合物定义：即酶标记的抗体（或抗原）。特点：既保有酶的催化活性也保持抗体（或抗原）的免疫活性要求：酶与抗体（或抗原）之间恰当的分子比例不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）结合物要有良好的稳定性36免疫反应即抗体抗原反应特点不仅发生在生物体内在体外也能进行反应是高度特异性的遵循质量作用定律以抗原与抗体的特异性可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫分析37二、ELISA的理论基础抗原或抗体的固相化:仍保持其免疫学活性抗原或抗体的酶标记:既保留免疫学活性又保留酶活性受检样本中抗体或抗原与固相载体表面的抗原或抗体起反应洗涤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开加入酶标记的抗原或抗体，通过反应而结合在固相载体上,固相上的酶量与样本中受检物质的量呈一定比例关系加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与样本中受检物质的量直接相关38双抗体夹心法测抗原或双抗原夹心法测抗体三、ELISA的类型39间接法测抗体40捕获包被法测抗体41竞争法测抗体或竞争法测抗原42CLB残留的快速ELISA检测43一、测定原理微孔板上包被有固相化的羊抗兔的IgG样品或CLB标准品、酶标记物和CLB兔抗体加入到小孔中经过温育CLB兔抗体与固相化的羊抗兔IgG结合游离的CLB与酶标记物竞争抗体结合位点洗涤步骤后，没有结合的酶标记物等被除去加入显色液温育，结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物加入反应停止液后使颜色由蓝色转为黄色吸光强度与CLB浓度直接相关44阳性(positive)Wash1H2O2+TMBcolorlessNOCOLOR45阴性(negative)Wash1H2O2+TMBcolorless46阴性(negative)47二、操作步骤取出所需的微孔板条并插入框架内样品前处理准备工作液酶联免疫实验设计加样（各50ul）加酶联结合物(除空白孔,各50ul)倾空微孔板,用250ul冲洗液重复洗板5次0标样加克伦特罗抗体溶液(各100ul)该反应速度快，建议使用多道移液器轻轻敲击微孔板四周，室温20-25℃避光孵育30分钟平行试验试剂升温尿样离心洗液，样品稀释液，底物溶液标样空白添加样品加显色液(各200ul)加中止液(各50ul)室温20-25℃避光孵育30分钟充分混合450nm下读取OD值48三、测定步骤样品采集与前处理试剂准备与工作液配制加样温育洗涤显色比色结果判定49四、关键控制点固相载体：吸附性能，孔底透明度，板、孔性能差异包被物：纯度包被方式封闭：让大量不相关的蛋白质充填固相载体表面尚未被占据的空隙试剂盒选择50储存条件：2-8℃室温平衡：试验用试剂应提前1-2h从冰箱中取出，待温度与室温平衡后使用及时保存：试剂完毕后不需用的部分应及时放回冰箱保存蒸馏水或去离子水：应为新鲜和和高质量的试剂准备51使用新鲜样本进行必要前处理样本质量加样前样本必须混合均匀加在板孔底部，避免加在孔壁上部不可溅出，不可产生