内部核糖体进入位点-是一段核酸序列,它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5’帽结构

内部核糖体进入位点-是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5’帽结构内部核糖体进入位点-是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5’帽结构，从而使直接从mRNA中间起始翻译成为可能。通常来讲，真核生物翻译只能从mRNA的5’端开始，因为翻译起始必须依赖于5’端的帽子结构。学术术语来源——人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定文章亮点：在基因治疗中，联合应用多个具有协同作用的治疗基因通常可产生较单基因更为理想的效果。利用内部核糖体进入位点构建关于人白血病抑制因子与血管内皮生长因子165双基因共表达基因治疗载体的研究至今尚未见报道。实验旨在采用一种简便和高效的方法构建双基因共表达载体pIRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定。关键词：组织构建；组织工程；白血病抑制因子；血管内皮生长因子165；真核双表达载体；内部核糖体进入位点；转染；双PCR主题词：白血病抑制因子；血管内皮生长因子类；转染；聚合酶链反应摘要背景：人白血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患，利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目标：构建双基因共表达载体pIRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定。方法：是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因，然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-LIF-EGFP。人血管内皮生长因子165cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-LIF-EGFP中，最后构建成为含有IRES(即内部核糖体进入位点)的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。结果与结论：DNA测序显示，提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，片段大小分别为609bp和576bp。构建的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带，经BamHI/NotI双酶切后切出IRES-VEGF165片段，经EcoRI/NotI双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165mRNA和蛋白。结果证实，实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程