冷冻贮藏过程中鱼肉蛋白的变性-蛋白质化学课程论文

冷冻贮藏过程中鱼肉蛋白的变性姓名：学号：专业：课程名称：蛋白质化学授课教师：作为渔业大国，我国水产品产量稳定增加，2012全年全国水产品总产量达5907.68万吨，比上年增长5.43%；2013年全国水产品总产量6172万吨，比上年增长4.47%。鱼类与其他食品原料不同，水分含量高，肌肉组织细嫩，易腐败变质。在高温季节捕获后应迅速冷藏或冻藏，如不能及时加工处理，在微生物和酶的综合作用下蛋白质、氨基酸等分解，并释放大量的热，对质量产生极为不利的影响。因此为了保证原料鱼的质量，必须用冷藏或冻藏的方法进行保存，但在冷藏或冻藏过程中鱼肉蛋白质易发生冷冻变性，造成品质下降并影响后继加工产品的质量。1.鱼肉蛋白在冷冻贮藏期间的变性及变性机理鱼肉蛋白质由水溶性的肌浆蛋白、盐溶性的肌原纤维蛋白和不溶性的基质蛋白组成[1]。所谓鱼肉蛋白质的冷冻变性，是指鱼在冻藏条件下，即－12～－23℃条件下贮藏，蛋白质受物理或化学因素的影响，其分子内部原有的高度规律性的空间结构发生变化，致使蛋白质的理化性质和生物学性质都有所改变，但并不导致蛋白质一级结构的破坏，这种现象称为蛋白质的变性。1.1结合水的分离学说结合水的分离学说，即蛋白质中的部分结合水被冻结，破坏其胶体体系，使蛋白质大分子在冰晶的挤压作用下互相靠拢并聚集起来而变性，也可称为蛋白质分子的聚集变性(aggregation)。具有α-螺旋结构的蛋白质在冻藏过程中易发生聚集变性。该模型指出，当蛋白质冷却到冰点以下时，温度较低部分的水分子开始结晶，而其他部分的未冻结水分子则向冰晶处迁移，引起冰晶生长，最终蛋白质表面功能基团所结合的水分也会被移去，使这些功能基团游离出来而相互作用，从而使蛋白质分子间发生聚集。鱼肉肌原纤维蛋白中的肌球蛋白、肌动球蛋白中的肌球蛋白部分都具有α-螺旋结构，在冻藏中易发生聚集变性。研究发现，参与这些蛋白质聚集的键为氢键、离子键、疏水键和二硫键[3]。蛋白质聚集使其相应的物理化学性质发生改变。1.2水和水合水的相互作用蛋白质分子中复杂的三级、四级结构是由分子内的非极性键之间的疏水结合和分子间的氢键来维持的。这些键的分布状态和蛋白质周围的水分子所形成的构造、状态密切相关。冻结时由于冰晶的生成引起结合水和蛋白质结合状态的改变，使蛋白质分子内部有些键被破坏，有些键又重新生成，这涉及到蛋白质分子内部构造的变化，从而使蛋白质变性[4]。此外，肌肉组织结构因细胞内外生成的冰结晶而产生破坏，肌肉组织蛋白酶对蛋白质的水解作用，冻藏中氧化三甲胺还原产生的二甲胺和甲醛，脂质氧化生成的醛酮类物质，ATP分解产生的次黄嘌呤类物质，ATP降解和糖原酵解造成的pH值下降等因素均会导致蛋白质发生变性。1.3细胞液浓缩学说细胞液的浓缩学说，即在冷冻条件下，蛋白质自由水与结合水先后结冰，使蛋白质的立体结构发生变化而造成，同时，还由于细胞内外生成的冰结晶破坏，并引起肌肉中的水溶液浓度升高、离子强度和pH值发生变化，最终导致蛋白质变性，这种变性几乎是不可逆的冻结，使蛋白质因盐析作用而变性。这种观点往往被用来说明细胞内外冰的生成量及生成状态同蛋白质变性之间的密切关系。未冻结时，蛋白质分子以高度水化的折叠状蛋白质存在，这时，蛋白质多肽链上的非极性基团位于分子内部而避免了与水分接触，具有较高的熵，较稳定，同时，蛋白质分子内部的非极性基团相互作用形成的非极性键可使其更稳定。肉在冷冻过程中，随着结合水的冻结，冰晶形成会使蛋白质的水化程度大大降低从而使其链展开，形成水化程度很低的开链蛋白质。其未折叠部分暴露出非极性氨基酸，结果导致临近蛋白质间的疏水相互作用、氢键、二硫键、离子键等形成，最终导致蛋白质分子间构象重排、分子内发生聚集，也称作蛋白质多肽链的展(unfolding)变性。2.影响鱼肉蛋白变性的因素冷冻贮藏期间，引起鱼肉质量发生变化的因素包括：原料固有的品质、贮藏前后的处理和包装、贮藏温度、贮藏时间、冷冻速度、温度波动、反复冻融以及解冻方式等。其中冷冻速度和贮藏温度是影响鱼肉品质变化的关键因素。冷冻速度影响冰晶的大小、形成、数量和分布等。缓慢冷冻时，冰晶体大多在细胞的间隙内形成，冰晶量少而且粗大，多呈柱状或块状；冷冻速度越快，冰晶越细小，而且主要分布在细胞内，因此，水产品在冷冻时必须以最快的速度通过0～-5℃温度区，并且迅速达到冷冻所需的温度，这样才能使冰晶细而均匀，解冻后的鱼肉肌肉组织可塑性大、鲜度好，蛋白变性程度低，鱼肉不会发生很大程度的劣变。鱼肉贮藏温度越低，鱼体内各种导致腐败变质的物理化学、组织形态变化以及生化反应的速度也就越缓慢。这就要求贮藏温度的低温化，但是即使在最佳的冻藏条件下，鱼肉的质量也会不可避免地出现下降，并随着时间的累积而增加。3.肌原纤维蛋白在冻藏过程中物理化学性质的变化3.1肌原纤维蛋白空间结构的变化肌原纤维蛋白质(myofibrillarprotein)是构成肌原纤维的蛋白质，占肌肉中总蛋白的50%～70%，在离子强度0.5以上的中性盐溶液中，可以大致被完全抽提出来。肌原纤维在电镜下呈长的圆筒状结构，其直径为1～2μm。其横切面由粗丝和细丝交错穿插进行有序排列，以一条粗丝为中心，六条细丝呈六角形包绕在周围。纵切面有明暗相见的横纹，分为暗带(A带)和明带(I带)，I带中央有一条Z线。粗丝主要由肌球蛋白(myosin)组成，细丝主要由肌动蛋白(actin)组成。鱼肉在冻藏过程中，由于冰晶的形成及增大而使肌原纤维蛋白脱水变性，电镜结果显示肌原纤维的空间结构发生变化，出现明显的裂缝和空隙，粗细丝排列紊乱、松散，肌节、A带、I带以及横纹模糊甚至消失，Z线扭曲、断裂、严重时溶解消失，肌组织中出现大小不等的空泡；同时电泳图谱会出现色带变淡、消失或有新的条带生成，这都表明了肌原纤维蛋白变性，发生不同程度的降解。汪秋宽等[5]对在-20℃下冻藏210d后鲤鱼的肌原纤维蛋白进行电泳分析，在电泳图谱上发现了新的大分子带，这说明鲤鱼肌原纤维蛋白在冻藏过程中发生了交叉连接反应。Matthews等对冻藏的鳕鱼糜进行研究时，得到了同样的结果。汪秋宽等[5]还用电镜观察了在-20℃下冻藏210d后的鲤鱼肌原纤维蛋白，结果表明肌原纤维之间出现了空隙。Roura等在电镜下观察冻藏过程中鳕鱼的肌原纤维蛋白，也得到相似的结果。缪宇平等[8]对冻结过程中鲢鱼的肌原纤维蛋白进行电镜观察，发现当冻结到-18℃时，肌肉纤维之间开始出现大冰晶，当冻结到-35℃时，肌肉纤维之间冰晶较大，纤维扭曲，形状紊乱，这说明冻结前后肌肉纤维的组织结构发生了显著变化。3.2肌原纤维蛋白溶解性的变化蛋白质溶解性是指在一定条件下，肌肉中可以进入溶液的蛋白量与总的肌肉蛋白量的比值，且这部分溶解的蛋白质在一定的离心力作用下不应发生沉淀。肌原纤维蛋白包括肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、肌钙蛋白、辅肌动蛋白等。他们可以在离子强度0.5以上的中性盐溶液中被抽提出来，所以又叫盐溶性蛋白。在低温贮藏过程中，由于鱼肉肌原纤维蛋白发生变性，其盐溶性会发生变化。研究表明，冷冻贮藏期间肌原纤维蛋白的溶解性降低。且当冻藏温度高于冰结晶点时，冻藏温度越低，蛋白质变性越快，溶解性下降得越快；当冻藏温度低于冰结晶点，冻藏温度越低，蛋白质变性越慢，溶解性下降得也越慢；冻藏时间越长肌肉蛋白的溶解性越差。冻藏过程中由于氢键、疏水键、二硫键、盐键的形成往往会导致蛋白质溶解性的下降，且其下降程度与鱼种有关。罗永康对鲢鱼肉在－20℃和－10℃冻藏期间盐溶性蛋白含量的变化进行了研究，发现前6周分别下降到新鲜鲢鱼肉的49.7%和39.8%，分别下降了50.3%和60.2%。从第7周到第24周，盐溶性蛋白含量下降越来越慢，分别从49.7%和39.8%下降到30.1%和26%，表明贮藏温度越低，盐溶性蛋白下降越慢，蛋白变性程度越小。汪秋宽等[5]研究表明，鲤鱼在-20℃冻藏过程中，肌球蛋白的重链盐溶性下降最大，肌动蛋白盐溶性下降最小，而原肌球蛋白，肌钙蛋白保持相对稳定。3.3肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性的变化肌球蛋白的球状头部(S1)具有ATP酶活性，Ca2+可以激活其活性。所以Ca2+-ATPase活性是反映肌球蛋白完整性的一个重要指标。研究表明，冷冻贮藏期间肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性发生不同程度的下降，这表明冻藏破坏了肌球蛋白的完整性，发生变性，从而降低了肌原纤维蛋白的功能特性。不同鱼种在新鲜状态时Ca2+-ATPase活性不同是因为肌肉蛋白对处理的敏感性存在差异，也可能是因为肌肉蛋白天然结构的不同，Ca2+-ATPase活性的降低可能是由于肌球蛋白头部的结构发生了改变或聚集所致，且降低的程度取决于鱼的品种[9]。周爱梅等[10]研究发现鳙鱼和罗非鱼鱼糜在－20℃冻藏63d后Ca2+-ATPase活性分别降低100%和43.5%。鲤鱼在－20℃冷冻贮藏60d肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性降低。冻藏过程中冰结晶的形成、离子强度的增加，诱导肌球蛋白的变性、使肌动球蛋白的复合物破裂，致使ATPase活性降低。随着冷冻贮藏时间的延长，Ca2+-ATPase活性下降越显著，这表明肌球蛋白更易变性，特别是头部的变性。在冻藏过程中冰晶的形成及由此所带来的体系离子强度的增加都会导致肌球蛋白头部结构发生改变，从而使其Ca2+-ATPase活性下降。3.4肌原纤维蛋白巯基和二硫键含量的变化巯基对于稳定肌原纤维蛋白质的空间结构有着重要的意义，因此许多学者都认为巯基氧化形成二硫键是引起蛋白质分子间交叉、联结、聚合，进而导致肌原纤维蛋白空间结构发生变化的主要原因。研究表明，在冷冻贮藏过程中，肌原纤维蛋白的活性巯基易氧化成二硫键，因此经冷冻后其活性巯基或总巯基的含量减少，而二硫键的含量增加。巯基含量的减少可能是多肽内部或多肽间形成二硫键；也可能是由于蛋白质发生了聚集反应的结果。罗非鱼在－20℃冷藏15d后总巯基含量不断降低，且降低了初始值的33%，且巯基含量的降低伴随着二硫键的形成。肌球蛋白有42～43个巯基，其中SH1和SH2两种巯基位于肌球蛋白头部区域，它们与其ATPase活性有关。SHa集中在轻质酶解肌球蛋白上，它负责Mg2+-ATPase活性，与肌球蛋白重链(MHC)的氧化及二聚物的形成密切相关，促进巯基的氧化，总巯基含量的降低是由SHa的氧化引起的。3.5肌原纤维蛋白表面疏水性的变化蛋白质的表面疏水性反映的是蛋白质分子表面疏水性氨基酸的相对含量，也可以用它来衡量蛋白质的变性程度，对某种蛋白质来说，如果表面疏水性的增加则说明它的变性程度增加。研究发现，鱼肉经冷冻贮藏后，肌原纤维蛋白的表面疏水性增加。这表明冻藏引起蛋白变性，肌原纤维蛋白质分子伸展开，把非极性的氨基酸残基暴露在蛋白质分子的表面，破坏了蛋白质原来的排列方式，引起肽链的卷曲或螺旋结构的变化，形成不同于天然结构的状态[11]。冷藏期间蛋白疏水性的增加可能是因为蛋白质的去折叠及疏水性脂肪族和芳香族氨基酸的暴露。冷冻的白鱼肉肌球蛋白分子的疏水性氨基酸比红鱼肉更易暴露。参考文献[1]黄海，辛荣，王秀敏.鱼肉蛋白在低温贮藏时生化特性变化研究进展[J].食品研究与开发，2009,30(2):149-154.[2]周爱梅，曾庆孝，刘欣等.冷冻鱼糜蛋白在冻藏中的物理化学变化及其影响因素[J].食品科学，2003,24(3):153-157.[3]RAMIREZJA,MARTIN-POLOMO,BANDMANE.Fishmyosinaggregationasaffectedbyfreezingandinitialphysicalstate[J].JournalofFoodScience,2000,65(4):556-560.[4]曾名湧.几种主要淡水经济鱼类肌肉蛋白质冻结变性机理的研究[D].青岛:中国海洋大学,2005:28-30.[5]汪秋宽，李振民，刘俊荣.鲤在-20℃冻藏过程中的质构变化[J].水产学报，1997,21(2):185-188.[6]袁春红，陈舜胜，程裕东等.冻结条件与冻藏温度对鲢鱼肉肌原纤维蛋白冷冻变性的影响[J].上海