冷鲜猪肉中假单细胞酶的分离机器鉴定方法

《冷鲜猪肉中假单胞菌的分离及其鉴定方法》一、知识背景微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。在微生物的研究及其应用中，不仅需要通过分离纯化技术，从混杂的天然微生物中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养的纯洁，防止其他微生物的混入。微生物培养常用到一些器皿例如：试管、玻璃烧瓶等，灭菌有几种方式，最常用的是高压蒸汽灭菌。它可以杀灭所有的生物。假单胞菌是细菌的一科。直或稍弯的革兰氏阴性杆菌。以极生鞭毛运动，不形成芽孢，化能有机营养，严格好氧，呼吸代谢，从不发酵。模式属为假单胞菌属。此属有29种。其中至少有3种对动物或人类致病。（见假单胞菌感染）菌种的保藏技术：1斜面菌种低温保藏、2斜面菌种液体石蜡油保藏、3基质培养基菌种的保藏、4蒸馏水保存、5液氮超低温保存、6营养液保藏法、7冷冻保存法。非细胞型微生物是结构最简单和最小的微生物，它体积微小，能通过除菌滤器，没有典型的细胞结构，无产生能量的酶系统，只能在宿主活细胞内生长增殖的微生物。这种微生物仅有一种核酸类型，即由DNA或RNA构成核心，外披蛋白质衣壳，有的甚至仅有一种核酸不含蛋白质，或仅含蛋白质而没有核酸。如病毒、亚病毒)、朊粒二、课堂报告的目的通过做这个论文，让我们了解一些关于微生物的一些专业知识如何杀菌、分离培养、菌种的保存、微生物的分析和相关的技术、动物实验模型。和原核微生物、真核微生物的形态结构与功能。三、课堂报告的思路看了教科书上的2，3,4,5章，思考假单胞酶与微生物有什么关系，之间有什么关联。四、课堂报告的正文鲜肉中的微生物1.鲜肉中微生物的来源内源性来源主要指动物屠宰后，体内或体表的微生物进入肌肉。外源性来源是动物在屠宰、加工、运输等过程中，微生物从水、用具、人员等外界环境中进入肌肉，这是主要污染来源。2.鲜肉的成熟与腐败动物屠宰后一段时间内，肌肉在酶的作用下发生复杂的生物化学变化和物理化学变化，称肉的“成熟”。在成熟过程中，肌肉中的糖原分解，乳酸增高，ATP转化为磷酸，使肌肉由弱碱性变为酸性，抑制了肉中的腐败菌和病原微生物的生长繁殖；蛋白质初步降解，肌肉、筋腱等变松软，并形成明显的气味和味道，这些变化有利于改善肉的风味和可消化性。成熟肉表面形成一层干燥膜，有羊皮纸样的感觉，可防止微生物的侵入。成熟之后，在环境适宜时，肉中污染的细菌、酵母菌、霉菌等开始繁殖，引起蛋白质、脂肪、糖类等分解，使肉腐败变质。3.冷鲜猪肉中的病原微生物及其危害（1）肉中的病原微生物肉中污染的微生物主要有细菌和霉菌，有时还出现酵母菌和致病菌。芽孢杆菌、假单胞菌及某些酵母菌能使鲜肉发黏和变色；变形杆菌、枯草杆菌及霉菌能使肌肉发霉和腐败。病原微生物可经内源性和外源性途径进入肉内。肉中可能的病原微生物有炭疽杆菌、结核分支杆菌、布氏杆菌、沙门氏菌、鼻疽杆菌、钩端螺旋体、口蹄疫病毒等人畜共患传染病的病原，还有各种动物传染病的病原。（2）肉中病原微生物的危害①导致传染病的流行带有活的病原微生物的肉类被人畜食用，或者在运输、加工过程中感染了健康人畜，都会引起传染病的发生和流行。②导致细菌性食物中毒因食用被病原菌及其毒素污染的食品而引起的人和动物的中毒称细菌性食物中毒。肉制品被沙门氏菌、致病性大肠杆菌、变形杆菌、副溶血弧菌、葡萄球菌或肉毒梭菌的毒素污染时，能引起细菌性食物中毒。另外，少数真菌也能通过肉品引起食物中毒。加强动物宰前检疫，保证屠宰场所及肉品市场的卫生，对肉品进行冷藏，搞好宰后检疫和肉品卫生检验等，都是保证肉品卫生质量的有效措施。（二）肉制品中的微生物1．冷藏肉和冰冻肉中的微生物肉类的低温冷藏和冰冻，在肉品工业中占有重要地位。低温虽能抑制微生物的生长繁殖，但能耐低温的微生物还是相当多的。如沙门氏菌，在-165℃可存活3d，结核分支杆菌在-10℃可存活2d，口蹄疫病毒在冻肉骨髓中可存活144d，炭疽杆菌在低温也可存活。所以不能以冷冻作为带病肉尸无害化处理的手段。肉类在冰冻前必须经过预冻，一般先将肉类预冷至4℃,然后采用-23～-30℃速冻，最后在-18℃冰冻保藏。2．熟肉中的微生物熟肉制品中包括酱卤肉、烧烤肉、肉松、肉干等，经加热处理后，一般不含有细菌的繁殖体，但可能含少量细菌的芽孢。引起熟肉变质的微生物主要是真菌，如根霉、青霉及酵母菌等，它们的孢子广泛分布于加工厂的环境中，很容易污染熟肉表面并导致变质，因此，加工好的熟肉制品应在冷藏条件下运送、贮存和销售。3．香肠和灌肠中的微生物灌肠类肉制品系指以鲜（冻）畜肉腌制、切碎、加入辅料，灌入肠衣后经风（焙）干而成的生肠类肉制品，或煮熟而成的熟肠类肉制品。前者如腊（香）肠，后者如火腿肠等。与生肠类变质有关的微生物有酵母菌、微杆菌及一些革兰氏阴性杆菌。熟肠类如果加热适当可杀死其中细菌的繁殖体，但芽孢可能存活，加热后及时进行冷藏，一般不会危害产品质量。4．腌腊肉制品中的微生物腌制是肉类的一种加工方法，也是一种防腐的方法。这种方法在我国历史悠久，一直到现在还普遍使用，肉的腌制可分为干腌法和湿腌法。腌制的防腐作用，主要是依靠一定浓度的盐水形成高渗环境，使微生物处于生理干燥状态而不能繁殖。用固体培养基分离纯培养法1.稀释倒平板法（pourplatemethod）先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。2.涂布平板法（spreadplatemethod）由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。3.平板划线法（streakplatemethod）用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。4.稀释摇管法（dilutionshakeculturemethod）用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式*。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植液体培养基分离纯培养法：接种物在液体培养基中进行顺利稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物如果经稀释后的大多数试管中没有微生物的生长那么有微生物生长的试管得到的培养物就有可能是纯培养物。微生物鉴定的依据获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN分析和16SrDNA序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种微生物鉴定的技术与方法根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平；在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。经典分类鉴定法经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表阿德逊氏分类法()。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50～60个，多者可达100个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱，再结合主观上的判断(如划分类似程度大于85％者为同种，大于65％者为同属等)，排列出—个个分类群。随着分子生物学的发展，细胞化学组分分析用于微生物分类日趋显示出重要性。细胞壁的氨基酸种类和数量现己被接受为细菌属的水平的重要分类学标准。在放线菌分类中，细胞壁成分和细胞特征性糖的分析作为分属的依据，已被广泛应用。脂质是区别细菌还是古菌的标准之一，细菌具有酰基脂(脂键)，而古菌具有醚键脂，因此醚键脂的存在可用以区分古菌。霉菌酸的分析测定己成为诺卡氏菌形放线菌分类鉴定中的常规方法之一。鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇杆菌等细胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有无可作为此类细菌的一个重要标志。此外某些细菌原生质膜中的异戊间二烯醌，细胞色素，以及红外光谱等分析对于细菌、放线菌中某些科、属、种的鉴定也都十分有价值。五讨论的问题假单胞酶在人类生活中有哪些关联