分子生态学

161.什么是分子生态学?答：分子生态学的诞生是以1992年的《MolecularEcology》创刊为标志的，目前较为一致的看法是：分子生态学是应用分子生物学的原理和方法来研宄生命系统与环境系统相互作用的机理及其分子机制的科学[1,2]。它是生态学与分子生物学相互渗透而形成的一门新兴交叉学科，其特点是强调生态学研宄中宏观与微观的紧密结合，用分子生物学的方法来解决种群水平的生物学问题[3]。2.什么是遗传多样性？衡量遗传多样性水平的参数有哪几个？1)什么是遗传多样性？答：J.McNeely(1990)的定义将遗传多样性定义为：蕴藏在地球上的植物、动物和微生物个体基因中的遗传信息的总和。世界资源研究所(WRI)1992年在“全球生物多样性策略”纲领性文件中明确地定义为：遗传多样性是指种内基因的变化，包括同种显著不同的群体间或同一群体内的遗传变异。是对一个种群的基因库中遗传因子多样化的测度。[4]2)衡量遗传多样性水平的参数有哪几个？答：整体杂合度、多态位点的比例和各位点的平均等位基因数等(Hedrick,1985;Nei,1987;RichardsandLeberg,1996)。具体如下：等位基因频率和等位基因数；杂合度、基因多样性和多态信息含量；F-统计量。[5]3.什么是种群遗传结构，怎么样表示种群遗传结构？答：种群的遗传结构(Populationgeneticstructure)是指一个种群内的遗传变异程度及其在群体间的分布模式，或指种群中各种基因的频率以及由这些基因决定的基因型的数量和分布情况（曲若竹等，2004）。用基因频率、基因型频率、交配与繁殖模式、种群遗传分化、种群间基因交流模式等表示种群的遗传结构。[6]4.什么是遗传漂变、有效种群大小、种群瓶颈、奠基者效应（建群者效应）？遗传漂变指在群体遗传学中，由小群体引起的基因频率随机减少甚至丢失的现象。[7]有效种群大小是指一个种群中能将其基因连续传递到小一代的个体平均数。实际上相当于理想状态下（种群大小的稳定，世代之间没有重叠，所有个人以相同的概率给下一代贡献配子）种群的大小。种群的瓶颈效应(bottleneck)指的是由于某种原因，种群内个体数目大幅度而且快速地减少。[8]奠基者效应(foundereffect)即由少数个体的基因频率决定了他们后代中基因频率的效应。5.应用于谱系地理学（亲缘地理学）的分子标记方法有什么？谱系地17理学能解决哪些问题？分子谱系地理学研究方法主要用到的是DNA分子标记技术，包括随机扩增多态性DNA（RAPD）、序列特异扩增区域（SCAR）、限制性片断长度多态性（RFLP）、扩增片断长度多态性（AFLP）、简单重复序列间扩增（ISSR）等分子生物学技术。最早的研究遗传结构的分子标记，是基于细胞中的大分子的细胞学和生化标记，这种标记受外界因素的影响较大，不够精确的；染色体标记的标记能力有限，而DNA分子标记是基于遗传物质本身的标记，是DNA水平上的遗传多态性的直接反映，是继形态学标记、细胞学标记及生化标记之后，近年来广泛应用的一种新的遗传标记。它有许多优点：直接以DNA作为研究对象，在植物体各个组织、各个发育时期均可检测到；标记数量极多，遍及整个基因组；多态性高，自然存在着许多等位变异；有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息。6.保护遗传学对物种的保护有什么意义？举一例。答：保护遗传学的研究内容对珍稀濒危物种的保护管理策略的制定和实施上具有重要的理论意义和科学的指导作用，因而保护遗传学研究已越来越受到保护生物学家的高度重视，不仅在许多重要的珍稀濒危动物的保护计划的实施中得到了广泛应用，而且也影响到了一些保护政策的制定和修改。举例：美国红狼(Canisrufus)的保护地位问题。红狼是个独立种还是灰狼(Canislupus)的一个亚种一直有所争论,形态学和分子遗传学研究结果证实红狼是灰狼一亚种与丛林狼(Canislatrans)间的杂交种。由于原有的保护政策规定对杂交种不予保护,因此红狼受该政策的限制处境危险。为保护这一珍稀类群,美国根据保护遗传学的研究结果对一些保护政策进行了调整。7.小而孤立的种群会有什么遗传学影响？答：种群变小的两个遗传学后果是增强了遗传漂变和近交的作用。遗传漂变是指等位基因频率，由于只有少数亲代等位基因可以传入下一代（取样效应），而产生的随机变化。在大种群中由取样效应引起的基因频率随机变化是很微弱的，基本上可以忽略；但在小种群内这种变化往往很显著而且没有固定方向。近交指有亲缘关系个体之间的交配。植物的近交通常经过两条途径发生：自交和双亲近交。自交是一种极端的近交类型，经常由于植物的自交不亲和以及雌雄异株而不能发生。双亲近交经常发生在种群很小或表现出空间遗传结构的情况下。如果通过花粉或种子进行的基因扩散只出现在有限的空间范围内，那么空间遗传结构就会很容易产生。任何个体数量有限的种群都经历着遗传漂变；种群越小遗传漂变的影响就越显著。8.简要介绍DNA测序技术及其发展趋势。第一代测序技术：第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解），并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基。自此，人类获得了窥探生命遗传差18异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP，ddCTP，ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。第二代测序技术：第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其存在测序成本高，通量低等缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性。Roche公司的454技术：GSFLX系统的测序原理是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。illumina公司的Solexa：它的核心思想感是边合成边测序（sequencingbysynthesisorligation,SBS&SbL）。即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应崔化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。Solid技术：SOLiD使用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。第三代测序技术：测序技术在近两三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。PacBio公司的SMRT：PacBioSMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。PacBioSMRT技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW（零模波导孔）原理：如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。小孔直径有考究，如果直径大于微波波长，能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来，从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长，能量不会辐射到周围，而是保持直线状态（光衍射的原理），从而可起保护作用。19同理，在一个反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔，即ZMW(零模波导孔)，外径100多纳米，比检测激光波长小(数百纳米)，激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限制在一个小范围(体积20X10-21L)里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%,但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。OxfordNanoporeTechnologies公司所开发的纳米单分子测序技术：它是基于电信号而不是光信号的测序技术。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。DNA测序技术的发展趋势：DNA测序技术的发展是建立在人们对其实际应用的渴望，目前的基因检测有三大领域，分别是:生殖与遗传健康、肿瘤个性化诊断和健康人群疾病预防与检测。1）在生殖与遗传健康中基因检测的发展趋势在我国，降低遗传病的发病率任重而道远。每年有出生缺陷的婴儿就达到了100万人。大部分都是由于基因缺陷导至的罕见病。罕见病是指那些发病率极低的疾病，又称“孤儿病”，在中国没有明确的定义。根据世界卫生组织（WHO）的定义，罕见病为患病人数占总人口的0.65‰～1‰的疾病。国际确认的罕见病有6000-7000种，其中80%是由于基因缺陷所导至的，具有遗传性。我国罕见病患者有1600万左右。许多罕见病治疗费用十分昂贵或者干脆无药可治，给罕见病患者家庭带来沉重的负担。与此同时，国内大部分医疗机构缺乏罕见病的诊断与分析能力，经常导至患者因误诊花费巨大且错过了最佳治疗期。目前临床没有任何一种诊断能够同时对所有罕见病进行筛查，但基因检测技术的发展为此提供了可能。未来，无论从国家、医院、还是个人角度，通过基因将检测降低我国罕见病的发病率提高诊断水平将是大势所趋。同时，为了有效缓解新生儿罕见病发病率，未来孕前、产前、新生儿筛查的三级预防体系的构建也是至关重要。从而做到及时预防并发现新生缺陷儿童，并选择最佳治疗期降低患者及其家庭的负担。从测序服务公司来说，简单的拥有1-2个产品并不能构筑长久的竞争优势。未来必然是在孕前、产前、新生儿筛查领域拥有多个产品，为医院提供一站式解决方案的公司才能成为该领域的龙头。2）在肿瘤个性化诊断中基因检测的发展趋势对大部分早、