分子生物学期末考试复习资料

分子生物学参考题答案1、请简述实时定量PCR的过程和基本原理。原理：具体实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。过程：1.在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质2.随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。3.经过一个循环，收集一个荧光强度信号4.通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。2、请简述蛋白质生物合成的三个主要过程。一、氨基酸的活化：氨基酸必须在氨酰-tRNA合成酶作用下生成活化氨基酸AA-tRNA。氨基酰tRNA的形成是一个两步反应过程1.氨基酸与ATP作用，形成氨基酰腺嘌呤核苷酸；2.氨酰基转移到tRNA的3-OH端上，形成氨酰tRNA二、肽链的起始、伸长和终止（1）翻译的起始：1.蛋白质合成的起始需要核糖体大、小亚基，起始tRNA和几十个蛋白因子的参与，2.在模板mRNA编码区5’端形成核糖体-mRNA-起始tRNA复合物3.将甲酰甲硫氨酸放入核糖体P位点。（2）翻译的伸长：肽链的延伸有许多循环组成，每加上一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括进位、成肽和移位。（3）翻译的终止：1.当mRNA上终止密码出现后，没有相应的AA-tRNA与之结合2.而释放因子（RF）能识别终止密码子并结合，水解P位上多肽链和tRNA之间二硫键。3.多肽链合成停止，肽链从核糖体中释出，mRNA、核蛋白体等分离三、新合成多肽链的折叠和加工：1.新生成的肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。2.N端fMet/Met的切除、二硫键的形成、特定氨基酸的修饰（磷酸化、糖基化和甲基化）和切除新生肽链的非功能片段3、请简述酵母双杂交技术实验原理。1.巧妙利用真核生物转录调控因子的组件式结构2这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。3.BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。4、请简述免疫共沉淀技术的实验原理和主要步骤。实验原理：1.这一技术的核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白2.如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一种蛋白也会被沉淀主要步骤：（1）将靶蛋白的抗体通过亲和反应连接到固体基质上（2）再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系（3）用低离心沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白质复合物沉淀到试管底部或微膜上5、请论述真核生物与原核生物在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面的异同点。1）在真核细胞中，成熟mRNA为单顺反子mRNA，很少存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。2）真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。3）高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间存在不被翻译的内含子。4）真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。5）在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于转录起始位点上游不远处，在真核生物中，基因转录的调节区则大得多6）真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质。原核生物中不存在这样严格的空间间隔。7）许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能被顺利地翻译成蛋白质。6、请简述核小体的组成和结构特征。组成:核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA组成的。结构：1.串珠样结构2.DNA盘绕组蛋白八聚体核心，从而使分子收缩成1/7。3.核心颗粒包括组蛋白八聚体及与其结合的146bpDNA，该序列绕在八聚体外面1.75圈。7、请简述真核基因组独特的结构特点。（1）真核基因组结构庞大（2）基因的转录产物为单顺反子（3）真核基因组含有大量重复序列（4）真核基因中存在非编码序列和间隔区（断裂基因），故具有不连续性（5）真核基因组存在大量的顺式作用元件（6）真核基因组有端粒结构8、请简述DNA的半保留复制及其生物学意义。1.DNA生物合成时母链解开为两股单链，各自作为模板，按碱基互补配对规律，合成与模板互补的子链2.子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是完全重新合成的3.两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致生物学意义：DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性；保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代，体现遗传的保守性。9、什么是“基因”？并论述真核生物mRNA的结构特征及其生物学意义。基因：染色体上有遗传效应的DNA片段，通常指产生一条多肽链或者功能RNA所必需的全部核苷酸序列。结构特征：1.真核生物mRNA的5’端存在“帽子”结构。绝大多数真核生物mRNA具有polyA尾巴；2.真核细胞的前mRNA有相应的前体，会被加工剪接为成熟的mRNA翻译3.真核细胞的mRNA多是单顺反子，即一条mRNA编码一条多肽4.真核生物mRNA的转录在细胞核，翻译在细胞质生物学意义1.保持mRNA的稳定性，阻止被酶降解2.提高翻译效率，提高剪接效率10、请论述遗传密码子的特点和存在的生物学意义。1.连续性：编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。2.简并性：遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个或多至6个三联体为其编码。3.通用性：蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。4.摆动性：转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反向配对结合，但反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。生物学意义：1，遗传密码子的连续性，保证翻译速率2，遗传密码的简并性，可以减少有害突变，维持物种稳定性。3，遗传密码的通用性，说明生物有共同的起源。4，遗传密码的摆动性，使基因突变造成的危害程度降至最低。11、请论述泛素-蛋白酶体系统以及介导蛋白质降解的主要步骤，并阐述泛素-蛋白酶体系统异常可能引起的疾病。泛素-蛋白酶体系统：一个多步骤反应过程，有多种不同蛋白质参与。蛋白质先被泛素（多肽）标记，然后被蛋白酶体识别和降解。包括泛素、泛素活化酶E1,泛素结合酶E2S,泛素-蛋白连接酶E3S,26S蛋白酶体,泛素解离酶DUBS步骤：1.泛素的活化2.E1将活化后的泛素通过交酯化过程交给泛素结合酶E23.泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到目标蛋白质上并释放E2，形成特定的泛素化的蛋白质4.泛素化的蛋白质被特定的蛋白酶体识别并结合，最终在蛋白酶的催化下蛋白质分解为短肽或氨基酸疾病：1.泛素蛋白酶体与肿瘤2.神经退行性疾病3.糖尿病12、请简述进行PCR引物设计时一般遵循的原则。1.引物长度以15~30bp为宜。2.引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45~55%左右。3.引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3'末端不应有互补链存在。4.引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。5.原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。6.5'末端碱基并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其5'末端碱基可以不与模板DNA匹配而呈游离状态。13、请简述蛋白质印迹法的实验原理和主要实验流程。原理：1.经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上；2.固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变；3.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应；4.经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。实验流程：1.蛋白样品的制备2.经过SDS-PAGE分离的样品3.分离的蛋白转移到膜载体上，转移后将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附4.用固定在膜上的蛋白作为抗原，与对应的非标记抗体（一抗）结合5.洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性标记的二抗，通过显色或放射自显影来检测蛋白。14、乳糖操纵子模型（1）Z、Y、A基因产物由同一条多顺反子mRNA分子所编码（2）该mRNA分子的启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达。（3）操纵区是DNA上的一小段序列，是阻遏物的结合位点。（4）当阻遏物与操纵区相结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。（5）诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象，使之不能与操纵区相结合，诱发lacmRNA的合成。