分子生物学研究方法和技术

分子生物学研究方法和技术湖南省农业生物技术研究中心詹庆才电话：84691351Email:[e-mail]本人基本情况•1984年获湖南农学院农学学士学位。1987年获中国科学院遗传研究所理学硕士学位，专业:分子遗传。•1999年11月-200２年11月受国家科技部派遣，在日本农林水产省北海道国家农业研究中心博士后特别研究员；主要从事基因定位和功能基因的筛选。•１９８４－１９９９年：主要从事水稻细胞质雄性不育机理研究；水稻分子育种技术研究。•１９９９－２０１4：主要从事杂交水稻种子纯度快速鉴定技术研究；水稻品种ＤＮＡ指纹研究；基因定位和分子育种技术研究。课次课堂讲授第一次绪论植物总RNA提取第二次植物总DNA提取第三次核酸的凝胶电泳第四次聚合酶链式反应第五次微卫星分子标记快速鉴定杂交种子纯度技术第六次Southernblot、Northernblot、Westernblot第七次植物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳第八次基因定位方法第九次植物基因转化第十次cＤＮＡ和基因组ＤＮＡ文库的构建第十一次载体系统•1、分子生物学的发展历程•1871年，首次发现DNA（鲑精DNA）。1943年，证明DNA为遗传分子，而不是蛋白（1944，OTAvery）•1953年，DNA双螺旋模型提出（JDWatson（美）和FHCCrick（英），1962年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而为分子生物学这一学科奠基。1961年，合成mRNA，破译第一个遗传密码（MWNirenberg（美），1968年获诺贝尔生理学、医学奖）——基础研究的创新，与推动人类文明的进步。（以上被称为理论上的三大发现）•1970年，分离出第一个限制性内切酶（WArber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖）•1970年，Baltimore和Temin发现了逆转录酶•——长期的基础研究积累迎来了突飞猛进的高潮。•1973年，Cohen把质粒作为基因工程的载体使用•——基础研究向应用研究的拓展。•（以上被称为生物工程技术的的三大发明）•3个事例：•（1）1976年，重组DNA成功（HBoyer和SNColen，1981年获诺贝尔化学奖）——勇敢的科学精神。•（2）1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100克精制胰岛素。相当于从1600磅动物胰腺中的提取量——效率、成本、质量、竞争。•（3）荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年——后来居上。人类对生命现象的认识•20世纪个体→染色体→基因→DNA→SNP•生物与非生物间的界限消失了！•21世纪•基因克隆，拼结→组装植物、动物、婴儿！数、理、化相关学科生物学实验技术渗透交叉近代生物学生物学个性共性宏观生物学（生态学为核心）微观生物学（分子生物学为核心）细胞水平分子水平结构生物学，发育生物学，神经生物学等新兴学科发展生物多样性研究资源保护与利用人类生态环境的保护工农业生产持续发展现代生物学的发展分子生物学分子结构生物学分子发育生物学分子神经生物学分子育种学分子肿瘤学分子细胞生物学分子免疫学分子病毒学分子生理学分子考古学分子遗传学分子数量遗传学分子生态学分子进化学…………….分子生物学渗透到生物学几乎所有学科分子生物学成为现代生命科学的共同语言分子生物学的延伸2分子生物学的概念2.1分子生物学的定义2.2分子生物学的三大原则2.3分子生物学研究的三大主要领域2.4分子生物学发展的三大支撑学科2.1分子生物学的定义Molecularbiologyisthestudyofgenesandtheiractivitiesatthemolecularlevel,includingtranscription,translation,DNAreplication,recombinationandtranslocation.分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。分子生物学与生物化学之间的关系与区别分子生物学—研究生物大分子的结构、功能及信息传递过程，从分子水平研究生命现象。生物化学—生物体内的化学运动，包括化学组成、变化、结构与功能，生物分子间的物质与能量转换过程。分子生物学≠生物化学★构成生物大分子的单体是相同的★生物遗传信息的表达的中心法则相同DNARNApolypeptidesproteincharacter高级结构生物大分子之间的互作个性2.2分子生物学的三大原则共同的核酸语言共同的蛋白质★生物大分子单体的排列（核苷酸，氨基酸）结构生物学基因分子生物学生物技术理论论与应用2.3分子生物学研究的三大主要领域生物大分子的结构与功能生物大分子之间的互作DNA—proteinHormone—receptorEnzyme--substrate基因的概念基因的结构基因的复制基因的表达基因的重组基因的突变基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程狭义的分子生物学——分子遗传学2.4分子生物学发展的三大支撑学科1839-1847年MatthiasSchleiden&TheodorSchwann细胞的化学组成，细胞器的结构，细胞骨架，生物大分子在细胞中的定位及功能分子生物学发展的三大支撑学科之一•生物体由细胞组成•所有组织的最基本单元----形状相似，高度分化的细胞•细胞的发生与形成是生物界普遍和永久的规律CytologyMolecularCellbiologyGregorMendel1864年GeneticsMolecularGeneticsGenestructureGeneduplicationGeneexpressionGenerecombinationGenemutation分子生物学发展的三大支撑学科之二遗传因子假说GeneticsBiochemistryNucleicAcidChemistryProteinChemistry(1936年JamesSumner)分子生物学发展的三大支撑学科之三Enzymaticnatureofcrystalline（晶体）ProteinBiochemistry321世纪分子生物学展望3.1自然科学历史舞台角色的重大变化3.2未来生物学形成的新热点及领域3.3应用生物学发展3.421世纪—生命科学的世纪3.1自然科学历史舞台角色将发生重大变化引导自然科学向物质运动最高层次突破的带头学科物理学生物学3.2未来生物学形成的新热点及领域生物大分子的高级三维结构与功能的统一生物大分子之间的互作基因表达，基因互作器官发生胚胎形成个体发育结构生物学（StructuralBiology）分子发育生物学（MolecularDevelopingBiology）个体细胞分子整体论细胞中的定位细胞分化神经基质神经通道信息传递大分子克隆一级结构分析三维结构重建思维感情记忆科学解释分子细胞生物学(MolecularCellBiology)分子神经生物学（MolecularNeurobiology）计算机语言分辨，提取，分析，比较，预测生物信息生物大分子的结构与功能信息基因的识别与鉴定基因功能信息的提取与证实基因表达谱的绘制(microarray)蛋白质水平上基因互作的探测功能基因组学(FunctionalGenomicsorpost—Genomics)生物信息学(Bioinformatics)3.3应用生物学发展生物技术诊断试剂治疗药物植物品种环境工程食品加工生物塑料废物处理再生能源……3.421世纪——生命科学的世纪二十一世纪生命科学的世纪分子生物学理论的突破生物技术的有效应用新旧技术的有机结合人口与粮食能源与资源环境与生态健康与疾病更加深刻更为明确阐明生物大系统生长发育遗传变异繁殖死亡生命本质更加主动更为有效利用生物技术改造生物创造生物新兴产业推动工，农，医的发展学习分子生物学的意义第一章RNA的分离纯化主要内容前言一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分离提取核酸的主要步骤（一）细胞的破碎（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除（三）核酸的沉淀(四）核酸的浓度测定（五）核酸的保存核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。前言一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性1意义遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。2分离核酸原则：1）温度不要过高；2）控制一定的pH值范围(pH值5-9);3）保持一定的离子强度;4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.（二）防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。1.DNA酶抑制剂1）金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；2）阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。2.RNA酶（RNAase)抑制剂RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。(1)皂土（bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）剧毒。（3)肝素（4）复合硅酸盐（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)二分离提取核酸的主要步骤（一）细胞的破碎1高速组织捣碎机捣碎2玻璃匀浆器匀浆3超声波处理法4液氮研磨法5化学处理法(SDS、吐温80等）6生化法（溶菌酶、纤维素酶等）（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。常用方法：1.加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；2.加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；3.酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）。1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意（三）核酸的沉淀沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。1.核酸沉淀的盐类及浓度盐贮存液浓度（mol/L)终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.82.有机沉淀剂（1）乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含