PCR扩增和电泳检测

实验13DNA片段的PCR扩增1、用PCR技术对DNA进行扩增2、用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增后的DNA进行检测电泳观察PCR反应实验步骤DNA在体内复制的条件是什么？模板：酶：原料、能量：解旋酶、DNA聚合酶等。DNA分子的每条链dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物：温和的反应条件DNA分子的结构合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸dATPdGTPdCTPdTTP聚合反应机理：5'3'OPGOPA模板链CTA3'5'引物3'3'5'5'OHOPGOPAOOHTP模板链CTA3'5'引物3'3'3'5'5'5'POOHTPP3'5'DNA聚合酶不同细胞的细胞周期不同生物细胞需要的时间细菌一般是20~30分钟蚕豆根尖细胞17.3小时小鼠十二指肠细胞15.3小时人的肝细胞22小时人的宫颈癌细胞22.5小时PCR技术可在几小时内，将特定核酸序列扩增百万倍!PCR的概念PCR（PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应）是指在体外，通过特异DNA引物扩增核酸分子中某个特定区域的技术。PCR的反应体系DNA模板原料：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP)；酶：Taq聚合酶（嗜热细菌中分离得到）引物：（单链DNA片段）Mg2+（维持酶活性所必需）PCR缓冲液：维持pH，保护Taq酶PCR技术原理变性退火延伸PCR三步曲预变性保温变性90~95℃延伸70~75℃退火40~60℃PCR仪用于PCR的预混液（500L体系）：ddH2O310L10×butter50LMgCl240LdNTP混合液20L引物125L引物225L模板DNA25LTaqDNA聚合酶5L标记一个微量离心管，用取样器取20L的预混液加入到该管中。反应试剂用量PCRSuperMix10μL引物Ⅰ（浓度10μM）1μL引物Ⅱ（浓度10μM）1μL模板DNA5μLddH2O3μL总体积20μL微量可调移液器（一档吸、二档排）•PCR反应参数：变性94℃30s退火52℃30s延伸72℃60s预变性94℃300s保温72℃600s循环次数351、基本概念以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的作用下泳动的技术。2、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳基本原理制胶使用电泳缓冲液在制胶器上配制1.0%的琼脂糖凝胶。混样2μL载样缓冲液、2μL核酸荧光染料，10μLPCR产物混匀。点样将上步混好的样10μL加到凝胶孔中。电泳90V电压下电泳10~20min。琼脂糖凝胶电泳的过程将凝胶倒入制胶器的槽中（60oC）将琼脂糖加入电泳缓冲液,在微波炉中加热溶解至透明。制胶将梳子从制胶槽中拔出取出凝胶板放入电泳槽中向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用1、增加电导率；2、维持电泳过程中的合适的pH。吸取PCR反应产物10µL。注意吸头要插入到管底，才能取到PCR产物。将PCR产物与加样缓冲液充分混合（吸排几次）混样常用的上样缓冲液配方及各成分的作用蔗糖使样品呈色，便于上样，形成可见指示带，预测电泳进程。溴酚蓝增加样品密度，保证DNA均匀沉入加样孔内。核酸荧光染料可嵌合入DNA分子，在特定激发光源的激发下可发出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。（需要与加样缓冲液混合）加样进行电泳10-20分钟电泳•实验用的核酸荧光染料与DNA嵌合后，在DNA图谱观察仪的可见光下发射黄绿色荧光。电泳结果的观察在DNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。PCR的应用•PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。