分子印迹固相萃取技术在动物源食品中药物残留检测中的应用进展

分子印迹固相萃取技术在动物源食品中药物残留检测中的应用进展闫宏远,杨更亮*(河北大学药学院,河北省药物质量分析控制重点实验室,河北保定071002)摘要:以分子印迹材料作为特效吸附剂的分子印迹固相萃取技术具有从复杂样品中选择性吸附目标分子及其结构类似物的能力,较好地克服了由于样品复杂所带来的内源性干扰问题,因此非常适用于复杂样品的预处理与富集。本文介绍了分子印迹固相萃取技术的原理、最新进展以及相关萃取参数的优化过程,对近几年国内外分子印迹固相萃取技术在动物源食品中药物残留检测方面的应用进行了总结;阐明了分子印迹固相萃取技术在实际应用中存在的不足,并对其未来的发展进行了展望。关键词:分子印迹固相萃取;药物残留检测;动物源食品;应用中图分类号:O658文献标识码:A文章编号:10008713(2011)07057208ApplicationofmolecularlyimprintedsolidphaseextractionondrugresiduesinanimalsourcefoodsYANHongyuan,YANGGengliang*(CollegeofPharmacyofHebeiUniversity,KeyLaboratoryofPharmaceuticalQualityControlofHebeiProvince,Baoding071002,China)Abstract:Duetothesuperiormolecularrecognitionandgoodphysicalandchemicalstability,themolecularlyimprintedmaterialshavegainedmoreandmoreconcernrecentlyinextricationandseparationfields.Usingtheimprintedmaterialsasadsorbents,themolecularlyimprintedsolidphaseextraction(MISPE)allowsselectiveextractionofthetargetmoleculesanditsanaloguesfromcomplexmatrices,andissuitableforcomplexsamplepreparationandenrichmentprocesses.Thisarticledescribestheprinciple,latestprogressesandparametersofmolecularlyimprintedsolidphaseextractionandsummarizesitsextractionandapplicationsforthedeterminationofdrugresiduesofanimalsourcefoodsinrecentyears.Moreover,theshortcomingsandfutureprospectsofmolecularlyimprintedsolidphaseextractionarealsomentioned.Keywords:molecularlyimprintedsolidphaseextraction(MISPE);drugresiduedetection;animalsourcefoods;applications分子印迹技术(MIT)是20世纪末兴起的一项具有高选择性分子特异识别特性的功能材料制备技术[1]。分子印迹聚合物(MIP)作为一种新兴的分子识别材料,是模拟自然界存在的分子识别作用如酶与底物、抗体与抗原等特异性识别机制,由模板分子、具有结构互补的功能单体及交联剂共聚而形成在空间结构和结合位点上与模板分子完全匹配的聚合物[2]。该物质对模板分子具有可与生物抗体相媲美的选择性,同时具有一定的机械和化学强度,对酸、碱、有机溶剂、温度和压力均有一定的耐受性,且比生物抗体易于合成和贮存,在很复杂的化学环境中保持稳定。目前,人们对印迹材料分子识别机理的理解尚不深入,一般认为分子识别是MIP中特有的空间构型对样品中构型与之相同或相似的物质产生特效性的记忆效应。分子印迹材料的合成过程涉及诸多因素,包括模板分子大小与性质、功能单体、交联剂、致孔剂,引发剂、聚合时间和方式等;模板分子与功能单体需要形成稳定的复合物,且在合成过第7期闫宏远,等:分子印迹固相萃取技术在动物源食品中药物残留检测中的应用进展程中要形成尽量多的识别位点[3]。近年来凭借良好的专一性和卓越的分子识别性能,MIT在许多相关领域如色谱固定相、固相萃取、化学或生物传感器、不对称催化和模拟酶等方面得到了广泛应用,目前发展较为成熟的是在固相萃取分离方面的应用研究[4]。1分子印迹固相萃取技术实际样品的成分复杂,干扰物质较多,因此样品预处理通常是分析过程中最耗时和不易进行自动化的步骤。固相萃取(SPE)作为一种吸附萃取分离过程,将样品上载到填充吸附剂的一次性萃取柱中,分析底物和杂质被保留在柱上,然后分别用选择性溶剂去除杂质,洗脱出底物,从而达到分离的目的[5-8]。由于SPE具有形式多样、无需大量溶剂、易自动化的优点,目前被广泛用于制药工程、生物分离、食品分析和环境分析等方面[9-12]。SPE可根据填充剂和溶剂分为正相吸附、反相吸附、离子交换、空间排斥等多种类型,然而由于吸附作用主要基于不同极性、氢键、离子交换作用等,缺乏特异选择性,需对萃取和洗脱条件进行仔细的选择,因此应用于复杂生物及食品中痕量组分的萃取分离时易受到共萃取物质的干扰,具有一定的局限性[13]。MIP的特异亲和性使其具有从复杂样品中选择性吸附目标分子及其结构类似物的能力,可用作固相萃取剂选择性分离提取和富集复杂样品中的痕量被分析物,克服医药、生物及环境样品体系复杂、预处理繁琐等不利因素,因此非常适用于复杂样品预处理与富集过程[14-16]。最近几年发展起来的将MIP与SPE技术相结合的应用越来越多,采用分子印迹材料作为一种特效的固相萃取吸附材料较好地克服了由于样品复杂所带来的内源性干扰问题,不仅能用于富集分析物,而且能有效地除去样品基质的干扰,净化后的样品可以直接注入气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱/质谱(GC/MS)、HPLC/MS等仪器中进行分析[17]。近年来分子印迹固相萃取(MISPE)由于预识别能力较强,稳定性较好,制备方法简单,成本低,潜在的应用前景好而受到广泛的关注[18,19]。在选择MISPE过程之前要了解试样基质和分析物的性质,如结构、极性、溶解度和酸碱性、试样中分析物的浓度范围及可能存在的干扰组分情况等。MISPE通常将20~100mg印迹材料填入萃取柱中作为萃取固定相,萃取分离过程包括预处理、上样、淋洗(除杂质)及洗脱4个步骤(见图1),每个步骤均以溶剂为中心展开,各种溶剂的优化选择是其主要的任务之一[20,21]。MISPE应用中的主要影响因素有:(1)模板分子料聚合时单体和交联剂的相对用量对识别性能有直接的影响,通常模板用量为总量的2%~8%。同时功能单体的量不足容易导致识别点少且聚合物对目标分析物的结合能力弱;功能单体的比例过高则会增加较多无选择性的位点。由于非共价的分子间作用力较弱,在聚合反应时常常需要加入过量的功能单体,这会在萃取时造成严重的非特异性吸附,从而降低萃取选择性。交联剂用量增加有利于形成稳定和完整的印迹位点并且增大聚合物的刚性。(2)柱预处理的影响。底物与位点的结合能力与介质的性质密切相关,预处理的目的是创造一个与样品溶剂相容的环境并除去柱内杂质。通常使用初溶剂和终溶剂两种溶剂。初溶剂用于净化固定相,初溶剂的选择应与洗脱溶剂一样强或者强于洗脱溶剂,以便洗去所有可能与分析物一起流出的杂质。终溶剂是用于建立一个固定相环境以得到样品分析物的合适保留,故终溶剂应该与样品溶剂性质相似,若使用的溶剂太强,加样时柱中存留的预处理溶剂会干扰MIP对底物的选择从而降低回收率。对于弱极性目标分子而言,有机溶剂作为介质时可达到较好的识别能力。(3)上样液的影响。原则上采用非极性或弱极性溶剂溶解样品以减弱其对MIP中识别位点与底物分子相互作用的干扰,上样量取决于萃取柱的尺寸、类型、分析物的性质和浓度等因素,防止MISPE选择性萃取能力减弱和被测物损失。实际操作中可采用弱溶剂稀释试样、减少试样体积、增加SPE填料量和选择对目标物有较强保留的吸附剂等方式减少上样过程中分析物的流失。(4)淋洗液的影响。为了除去柱中残留样品及被MIP吸附的基质和杂质,需要使用适当强度的溶剂将干扰组分洗涤下来,同时使分析物仍保留在柱上。通常选择极性小且介电常数大的溶剂作为淋洗剂,如乙腈、氯仿、二氯甲烷等。当样品中的杂质与MIP非特异识别位点之间作用较强时,则需在不破坏特异性吸附的条件下增加溶剂极性,以破坏杂质点之间的相互作用。(5)洗脱剂的影响。洗脱剂的性质对MISPE的萃取效果和回收率有很大的影响,底物被选择性萃取后,使用小体积洗脱溶剂即可有效地从柱上解吸附对纯化和富集底物十分重要。在淋洗除去杂质后,需使用适当洗脱剂把目标物从萃取柱上洗脱出来,一般使用极性较强的洗脱剂如甲醇等,还可以在溶剂中添加少量的酸或碱,如乙酸、三氟乙酸和三乙胺等,也可采取如超声辅助、微分脉冲洗脱等辅助手段,以增强洗脱效果,缩短洗脱时间[22-24]。2分子印迹固相萃取在动物源食品分析中的应用随着经济全球化和国际食品贸易的日益扩大,食品安全尤其是动物源性食品中药物残留对环境和公众的健康构成的潜在危害受到了越来越广泛的关注。样品预处理与样品的复杂性密切相关,动物源食品如肉制品、蛋类和奶制品中的药物残留和有害物质检测的预处理尤其重要。由于许多动物源食品的基体和组成相当复杂,被分析物处于痕量状态,因而药物残留分析易受到干扰。样品前处理方法已成为食品安全分析的关键步骤,所用时间通常占整个分析过程的60%以上,并且超过30%的分析误差来源于样品前处理[25,26]。MISPE具有特异亲和力和选择性,可以克服复杂样品体系中预处理繁杂等不利因素,在选择性提取目标物的同时可有效消除大部分干扰组分,在食品安全检测中具有重要的研究潜力[27]。自1994年首次报道以戊脒为模板制备印迹聚合物并将该材料作为吸附剂对尿样中戊脒进行了提取、纯化和浓缩开始,MISPE在生物及食品样品中有害物质如农药、兽药、食品添加剂和违禁用药物的萃取分离应用已有较多的报道(见表1)。其中,MISPE应用于动物源食品中激素类药物的萃取分离受到了广泛的关注。Jiang等[28]以17β板分子采用本体热聚合方式制备了对3种内源性雌激素有高亲和力的印迹材料,并结合液相色谱对鱼和虾组织中痕量的17β行了检测,取得了较好的萃取净化效果,回收率为(84·8±6·53)%。Shi等[29]采用改进的仓促聚合法成功制备了对17β的单分散印迹微球,以甲醇10mmol/L磷酸盐缓冲液(6∶4,v/v)为淋洗剂、3mL甲醇作为洗脱液时回收率为86·5%~90·83%,相对标准偏差(RSD)小于5·02%。与传统的C18萃取相比,MISPE可消除基质内源性干扰,实现从复杂肉类和奶制品中高选择性萃取富集17β雌二醇药物。Wang等[30]以17模板,在300nm直径的硅球表面用溶胶接枝印迹涂层,并结合分散固相萃取法检测了鸡肉组织中的3种雌激素药物(回收率为72·5%~95·2%)。该方法有效避免了模板渗漏问题并加速了提取扩散速率。Jiang等[31]以己烯雌酚为模板、3交联剂,结合溶胶凝胶表面印迹技术制备了表面氨基化的印迹硅胶材料,并成功应用于萃取分离鱼产品中的痕量己烯雌酚。印迹和空白材料对己烯雌酚的最大静态吸附量分别为62·58mg/g和19·89mg/g,且较薄的印迹层可使吸附平衡在10min内完成。Liu等[32]以乙烯雌酚为模板,在聚乙烯中空纤维管外壁采用光引发共聚合方式接枝了分子印迹薄层,并应用合成的多孔高度交联复合印迹材料萃取分离牛奶中的双烯雌酚和己雌酚,显示出良好的协载能力和选择性