分子生物学实验-感受态的制备和转化

实验三感受态的制备及转化一、实验目的1．了解质粒DNA转化原理2．熟悉感受态细菌的制备和转化步骤二、实验原理1．感受态细胞与转化感受态指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109～1010转化子/ug闭环DNA。2.蓝白斑筛选野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶（lacZ）能将无色的化合物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside,X-Gal）切割成半乳糖和深蓝色化合物5-溴-4-靛蓝，使得整个培养的菌落产生颜色的变化变为蓝色。设计使用蓝白筛选的工程菌为β-半乳糖苷酶（lacZ）缺陷的菌株，这种菌株中β-半乳糖苷酶（lacZ）的染色体DNA发生突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶（lacZ）失去N端得146个氨基酸的短肽（α-肽）。从而不具有生物活性，即无法作用于X-Gal而产生蓝色物质。用于蓝白筛选的载体（如PUC系列）具有一个称为lacZ，的基因，该基因包括：一段编码β-半乳糖苷酶（lacZ）的启动子，编码α-肽的序列，一个多克隆区域（MCS）。MCS位于编码α-肽的序列的区域中，是外源性DNA的插入位点。虽然使用蓝白筛选的工程菌因为缺失了N端得146个氨基酸而不具有生物活性，但如果该菌株含有带有lacZ，的质粒以后，则质粒表达的N146个氨基酸和菌株染色体DNA表达的缺乏N端146个氨基酸的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整的β-半乳糖苷酶相似的作用，能将X-Gal分解为蓝色物质。X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶细菌感受态制备1将TOP10菌体培养过夜后，以1:100比例接种，继续培养3小时，于冰浴30min，分装EP管中，2500rpm，4℃离心5min2弃上清，沉淀加入1ml预冷0.1mol/LCaCl2重悬，置冰浴15min，2500rpm4℃离心5min3弃上清，沉淀加入0.2ml预冷0.1mol/LCaCl2轻轻悬浮（此时细菌易破碎），置冰浴。转化：1加入质粒DNA20ul，冰浴30min242℃热冲击2min后，迅速冰浴2min以上3加入800ulAmp-LB培养基，37℃培养一个小时，250rpm/min4取一Amp+LB平板，分别用40ulX-gal（20mg/ml）、4ulIPTG(200mg/ml)均匀涂于平板上5取10-100ul培养产物涂于Amp+LB平板6倒置平板，于37℃培养隔夜后，观察蓝白菌斑