分子诊断知识点

1、基因（gene）是含有生物信息的DNA功能片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的产物，包括RNA和蛋白质（多数）.2、基因组genome,指细胞或生物体一套完整的遗传物质，包括所有基因和基因间的区域（序列）。3、基因组学genomics以基因组为研究对象的一门学科，包括基因组作图、基因组测序、基因定位、基因功能分析4、结构基因：编码RNA或蛋白质的核苷酸序列5、基因表达：DNA携带遗传信息通过转录传递给RNA，mRNA通过翻译将基因的遗传信息在细胞内合成具有生物功能的各种蛋白质的过程6、C值基因组DNA全部碱基（对）数。C值是物种的一个重要特性常数。C值矛盾，C值悖论：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象7、N值矛盾，N值悖论：基因组中的基因数目与生物进化程度或复杂程度的不对称性8、必需基因（致死基因）关系到生物体存活的基因。可通过基因突变实验确定必需基因。：9、原核生物基因组1、细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体、放线菌、蓝绿藻等10、重叠基因:是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列为两个或两个以上基因的组成部分。11、操纵子：由一组功能相关的结构基因连同其上游调控序列共同组成一个转录单位12、质粒的分类致育质粒F质粒）编码性菌毛，介导细菌之间的接合传递；耐药性质粒R质粒）编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性；毒力质粒Vi质粒）编码与该菌致病性有关的毒力因子；细菌素质粒编码细菌产生细菌素；代谢质粒编码产生相关的代谢酶。13、严紧控制型拷贝数少，一般10个，分子量大；调节因子是蛋白质，复制受限，受染色体DNA复制系统的控制；严谨控制机理（低拷贝原因），认为是该质粒可以产生阻遏蛋白，反馈抑制自身DNA合成。松弛控制型拷贝数多，10-200个，分子量小；调节因子是RNA，复制不受染色体DNA复制系统限制基因工程使用松弛型（高拷贝数）质粒，以获得较多的基因产物。14、质粒性质1、质粒的转移：可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。2、质粒具有选择性标记：质粒有抗药性基因、营养缺陷型基因、抗重金属盐基因等多种选择性标记3、质粒的不相容性：质粒已成为分子克隆的有用工具，是目的DNA的载体。载体质粒大多是在天然质粒基础上经人工构建而成，15、质粒特点：1、有限制性核酸内切酶单一切口，可用以重组外源DNA；2、有筛选标记，如抗药基因等；3、插入外源DNA后，仍能转化宿主细胞，并能复制。16、质粒基因转移的方式1.接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DN从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用2.转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用3、转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用4、转染作用通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。17、完整的病毒颗粒包括：衣壳、基因组（DNA或RNA）、被膜、病毒颗粒中的其他内容物18、病毒分段基因组：流感病毒属分段RNA病毒：意义：a）降低包装压力b）降低了造成断裂的可能性，提高编码能力c)有分段基因组的病毒一般感染效率较低，只有全部基因组核酸片段存在时，病毒才具有感染能力。植物病毒d)由于分段基因组易发生重组，故病毒容易变异。19、病毒基因组特点：1、有特殊的末端序列：粘性末段、反向互补序列、长末端重复序列、帽和尾结构等；2、结构紧密，体现在不仅非编码序列少，而且有重叠基因的存在；真核生物20、染色体的包装：（1）染色体的一级结构—核小体（2）染色体的二级结构—螺线管3）染色体的三级结构—超螺线管（4）染色体的四级结构—染色单体21、真核生物染色体基因组一般特征1、真核生物的基因组比较庞大；2、线性双链DNA和二倍体；3、真核细胞基因转录产物为单顺反子。4、存在重复序列，重复次数可达百万次以上5、基因是不连续的（断裂基因）22、单顺反子：一个结构基因经过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一种蛋白质；23、重复序列：指多拷贝的相同或近似序列的DNA片段高度重复序列：按其结构特点分为三种：1、反向重复序列2、卫星DNA由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因而称为卫星DNA（或随体DNA）3、较复杂的重复单位组成的重复顺序中度重复顺序：依据重复顺序的长度，中度重复顺序可分为：短散布元件和长散布元件Alu家族是哺乳动物基因组中含量最丰富的一种中度重复顺序家族（短分散元件），Alu家族每个成员的长度约300bp，每个单位长度中有一个限制性内切酶AluⅠ的切点（AG↓CT），Alu可将其切成长130和170bp的两段，因而定名为Alu序列（或Alu家族）24、断裂基因（splitgene）：真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区相间隔但又连续镶嵌而成，为一连续的氨基酸组成的完整的蛋白质编码，或为具有特殊功能的tRNA或rRNA编码，因此称为断裂基因。并非真核生物所有的结构基因均为splittinggene例：组蛋白基因家族、干扰素、酵母中多数基因25、线粒体DNA的遗传特性：母系遗传、突变率高、异质性、阈值效应、半自助复制与协同效应26、阈值效应：mtDNA突变导致氧化磷酸化水平降低，当突变的mtDNA达到一定比例时，使得线粒体总的能量供应降低到维持组织正常功能所需能量的最低值时，才可能引起某组织或器官的功能异常而出现临床症状。27、DNA分子多态性的主要方式：微卫星DNA多态性（同一位点不同个体之间有不同长度的微卫星DNA）、单个核苷酸的变异—单核苷酸多态性（SNP）等28、STR结构：微卫星DNA又称短串联重复STR，指以1－6个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列。微卫星DNA结构序列由中间的核心区（重复序列）和外围的侧翼区（非重复序列）组成，其核心序列为1～6bp，为高度重复序列。成因：1.姊妹染色单体的不均等交换2.复制滑移29、SNP：SNP是基因组中散在的单个核苷酸的变异形成的一种DNA分子多态性位置：编码区SNPcSNP）、基因周边区SNPpSNP）基因间SNPiSNP）SNP非编、码区：SNP编码区=5：1成因：单个核苷酸（碱基）置换：转换：嘧啶—嘧啶，嘌呤—嘌呤；颠换：嘧啶—嘌呤,嘌呤—嘧啶转换：颠换=3：1。蛋白质组1、蛋白质组：生物体的全套蛋白质；或一个生命单位的全套蛋白质2、蛋白质组特性：与基因组相比，蛋白质组有高度动态性：有组织特异性、生长发育特异性、生理病理状态特异性。3、研究的必要性：1、蛋白质的数量比基因的数量多（转录、翻译、翻译后水平的调控）2、基因组是静态的，蛋白质组是动态的3、蛋白质之间及其与其它各种大、小分子之间的广泛作用形成的犹如网络状的复杂系统。4、蛋白质组学是研究生物体全套蛋白质的组成、结构与功能的科学5、蛋白质的分离：双向凝胶电泳及图像分析技术1、双向凝胶电泳2-DE：第一向的固相pH梯度等电聚焦电泳IPG-IEF第二向SDS-PAGE组成的分离系统：电泳速度只与蛋白质分子质量有关。原理：等电聚焦电泳:基于蛋白质等电点（pI）的差异进行分离；聚丙烯酰胺凝胶电泳:是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离6、质谱技术MS：（用于蛋白质的鉴定）是在高真空系统中样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比差异，以确定样品相对分子质量及分子结构的技术。7、质谱：化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质荷比大小依次排列而被记录下来的图谱，称为质谱。8、质谱仪的组成：离子源、质量分析器、检测器核酸分子杂交1、核酸变性：在理化因素作用下，维系DNA二级结构的氢键和碱基堆积力遭到破坏，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变2、核酸复性：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。3、分子杂交：不同来源的核酸变性后，合并在一起，只要这些核酸分子含有可以形成碱基互补配对的序列，复性也会发生在不同来源的核酸链之间，形成杂化双链4、分子杂交技术：用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来的技术。待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的DNA、RNA。5、核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的、带有标记的、并已知碱基序列的核酸片段。6、原位杂交：以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法7、寡核苷酸探针的特点及设计原则？特点:（1）根据需要来合成相应的核酸序列，避免了天然探针的缺点；（2）大多数寡核苷酸探针长度较短,一般为10~50bp,其序列复杂度低，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短；（3）寡核苷酸探针尤其适合点突变的检测(短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值)；（4）探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱。设计原则:（1）探针长度：一般要求在10～50bp;（2）G／C含量为40％～60％;（3）探针分子中应避免互补序列;（4）避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个;（5）探针与非靶基因序列的同源性不能超过70％或8个以上连续的碱基同源。8、一个理想的探针标记物应具备的特性？1、灵敏度高2、标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值3、标记物对检测方法无干扰4、检测方法要灵敏、特异、稳定、简便5、标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。9、Southern印迹杂交的基本步骤？其毛细管转膜的原理？Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。基本步骤：1、基因组DNA经限制酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳2、将含有DNA片段的凝胶放入变性溶液使DNA变性3、将固体支持物放在凝胶上，通过毛细管虹吸或电转移将脚上的DNA片段转移到固体支持物上，转移过程中，各DNA片段间的相对位置保持不变，然后通过加热使DNA固定于膜上4、加入探针使之与膜上的DNA杂交5、冲洗掉为杂交的探针，检测杂交信号10、毛细管虹吸印迹法其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上11、原位杂交时组织和细胞应固定处理，理想固定液应具备哪些条件？1、保持组织细胞的形态2、对核酸无抽提，修饰与降解作用3、不改变核酸在组织细胞内的定位4、不阻碍核酸与探针的杂交过程5、对杂交信号无遮蔽作用6、理化性质稳定12、如何增强组织的通透性和核酸探针的穿透性？组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体，影响探针的穿透和杂交体的形成；去垢剂和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质；控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落分子克隆（也称基因克隆或DNA克隆）：指按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体DNA重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。又称重组DNA技术1、制备目的基因主要有哪几种方法？直接分离、人工合成、构建基因组文库G-文库、构建cDNA文库C-文库2、载体：是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送到宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。载体化学本质为DNA分子。克隆载体：能将外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的