响应面法优化工程菌产细胞色素犘450犅犕3的发酵条件

书书书　第５７卷　第５期　　化　　　工　　　学　　　报　　　　　　　Ｖｏｌ．５７　Ｎｏ．５　２００６年５月　　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　（Ｃｈｉｎａ）　　Ｍａｙ　２００６檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭殐殐殐殐研究论文响应面法优化工程菌产细胞色素犘４５０犅犕３的发酵条件陆　燕１，梅乐和１，陆悦飞１，盛　清２，姚善泾１（１浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州３１００２７；２浙江理工大学生命科学学院，浙江杭州３１００３７）摘要：采用快速有效的数学统计方法对工程菌产细胞色素Ｐ４５０ＢＭ３的发酵条件进行了优化．首先利用ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计从众多影响产Ｐ４５０ＢＭ３的因素中筛选出影响较大的４个因素：ＦｅＣｌ３含量、诱导时机、诱导时间和接种量．在此基础上再利用响应面法中的杂合设计进行优化，通过拟合得到响应曲面函数，获得了最佳的实验条件．在该实验条件下，Ｐ４５０ＢＭ３酶活从３７．６×１０－３Ｕ·ｍｌ－１提高到５７．９×１０－３Ｕ·ｍｌ－１．关键词：优化；Ｐ４５０ＢＭ３；ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计；杂合设计中图分类号：ＴＱ９２０　　　　　　　文献标识码：Ａ文章编号：０４３８－１１５７（２００６）０５－１１８７－０６犗狆狋犻犿犻狕犪狋犻狅狀狅犳犘４５０犅犕３犪犮狋犻狏犻狋狔狆狉狅犱狌犮犲犱犫狔犵犲狀犲犲狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵狊狋狉犪犻狀犫狔狉犲狊狆狅狀狊犲狊狌狉犳犪犮犲犿犲狋犺狅犱狅犾狅犵狔犔犝犢犪狀１，犕犈犐犔犲犺犲１，犔犝犢狌犲犳犲犻１，犛犎犈犖犌犙犻狀犵２，犢犃犗犛犺犪狀犼犻狀犵１（１犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犆犺犲犿犻犮犪犾犪狀犱犅犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵，犣犺犲犼犻犪狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犎犪狀犵狕犺狅狌３１００２７，犣犺犲犼犻犪狀犵，犆犺犻狀犪；２犛犮犺狅狅犾狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲，犣犺犲犼犻犪狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犎犪狀犵狕犺狅狌３１００３７，犣犺犲犼犻犪狀犵，犆犺犻狀犪）犃犫狊狋狉犪犮狋：ＦａｃｔｏｒｉａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｓｉｇｎａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｔｏｉｎｃｒｅａｓｅＰ４５０ＢＭ３ａｃｔｉｖｉｔｙｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｓｔｒａｉｎ．Ｉｎｉｔｉａｌｌｙ，ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎｄｅｓｉｇｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｖａｒｉａｂｌｅｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅｒｅｌｅｖａｎｔｔｏｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＰ４５０ＢＭ３．Ｆｏｕｒｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｐａｒａｍｅｔｅｒｓｆｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｎｄｕｔｉｌｉｚｅｄｉｎｏｒｄｅｒｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓ．Ｗｉｔｈｔｈｅ４１６Ｃｍｏｄｅｌｏｆｈｙｂｒｉｄｄｅｓｉｇｎ，ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｓｗｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ，ａｎｄＰ４５０ＢＭ３ａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｏ５７．９×１０－３Ｕ·ｍｌ－１ｆｒｏｍ３７．６×１０－３Ｕ·ｍｌ－１ｂｙｔｈｅｂｅｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓａｔｏｐｔｉｍａｌｌｅｖｅｌｓｏｆ０．１２ｍｇ·Ｌ－１ＦｅＣｌ３，ｉｎｏｃｕｌｕｍｖｏｌｕｍｅｏｆ２．１％，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｔＯＤ５７８＝１．１，ａｎｄ６ｈｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；Ｐ４５０ＢＭ３；ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎｄｅｓｉｇｎ；ｈｙｂｒｉｄｄｅｓｉｇｎ　　２００５－０４－１３收到初稿，２００５－０６－２２收到修改稿．联系人：梅乐和．第一作者：陆燕（１９７８—），女，博士研究生．基金项目：国家自然科学基金项目（２０１７６０５０，３０５７０４１１）；浙江省科技计划项目（２００４Ｃ３３０３６）；教育部和浙江省留学回国人员基金项目．　引　言细胞色素Ｐ４５０ＢＭ３又称ＣＹＰ１０２，最初由Ｍｉｕｒａ和Ｆｕｌｃｏ［１］从犅犪犮犻犾犾狌狊犿犲犵犪狋犲狉犻狌犿中分离出来，并确定为细胞色素Ｐ４５０酶系的第Ⅱ类酶［２４］．通过对细胞色素Ｐ４５０ＢＭ３的血红素和黄素部位的结构分析，发现它与微粒体细胞色素Ｐ４５０有很高的相似性，目前Ｐ４５０ＢＭ３已作为哺乳动物微粒体Ｐ４５０单加氧酶重要的模型［５］．　　犚犲犮犲犻狏犲犱犱犪狋犲：２００５－０４－１３．犆狅狉狉犲狊狆狅狀犱犻狀犵犪狌狋犺狅狉：Ｐｒｏｆ．ＭＥＩＬｅｈｅ．犈－犿犪犻犾：[e-mail]犉狅狌狀犱犪狋犻狅狀犻狋犲犿：ｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（２０１７６０５０，３０５７０４１１）．　Ｐ４５０ＢＭ３能快速催化饱和或不饱和脂肪酸的末端氧化［２３］，它的突变体能氧化芘、菲、萘、芴等多种多环芳烃［６８］，如Ｓｃｈｍｉｄ等［９］利用定向进化得到的突变体可以把吲哚氧化为靛蓝．鉴于Ｐ４５０ＢＭ３催化反应的多样性，使它在药物、环境治理、化学工业中有着重要的应用价值．但由于工程菌产Ｐ４５０ＢＭ３酶的产量很低，规模制备存在难度，无法满足多方面的需要．因此，有必要对其发酵条件进行优化，以提高其产量，使其更好地满足各种需求．目前人们已经克隆出相关基因，并宿主到了大肠杆菌中成功得以表达，从多数的研究结果分析，影响Ｐ４５０ＢＭ３酶产量的因素除了培养基的组成外，还包括培养条件、诱导条件等，其可变因素较多，因此有必要从诸多影响因素中筛选出最为重要的影响因素．但到目前为止，常用的优化手段———单因素优化法（每次改变一个因素），往往忽略了各影响因素的交互作用．近年来发展起来的数学统计方法，包括线性回归、正交设计、ＥＶＯＰ等，虽能研究各影响因素的交互作用，并挑选出最为重要的因素，但这需要进行大量的实验．ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计基于不完全平衡板块原理，能从众多因素中筛选出最为重要的因素［１０］．响应面法中的杂合设计采用了较为合理的实验设计，能以最经济的方式，以较少的实验时间、数量对实验条件进行全面研究，从而得到更为明确、有目的性的结论．本研究拟先用ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计，对影响工程菌产Ｐ４５０ＢＭ３酶的诸多因素进行考察，从中筛选出最为重要的因素，再用杂合设计对此进行优化．１　材料与方法１１　材料１．１．１　菌株和质粒　基因工程菌由作者所在实验室构建．表达Ｐ４５０ＢＭ３的质粒ｐＥＴ２８，由德国斯图加特大学ＲｏｌｆＤ．Ｓｃｈｍｉｄ教授提供，由作者所在实验室经定向进化得到相应的突变酶［１１］，突变位点为Ｄ１６８Ｎ、Ａ２２５Ｖ、Ｋ４４０Ｎ．宿主菌犈．犮狅犾犻ＢＬ２１（ＤＥ３），对卡那霉素敏感，由浙江大学生物工程研究所保存．１．１．２　培养基　种子培养基和初始发酵培养基均为ＬＢ：５ｇ·Ｌ－１酵母提取物，１０ｇ·Ｌ－１胰蛋白胨，１０ｇ·Ｌ－１ＮａＣｌ，ｐＨ７．０．１２　实验方法１．２．１　培养条件　种子培养基中添加卡那霉素至终浓度为３０μｇ·ｍｌ－１，由斜面接入，１８０ｒ·ｍｉｎ－１、３７℃摇床过夜培养１２ｈ．发酵培养基中添加卡那霉素至终浓度３０μｇ·ｍｌ－１，将种子液按１％（体积分数）的接种量接入，１８０ｒ·ｍｉｎ－１、３７℃摇床培养至菌浓ＯＤ５７８约为０．８，加异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）至终浓度０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，于３０℃下诱导５ｈ．在该操作条件下，以装液量５０ｍｌ／２５０ｍｌ摇瓶的ＬＢ培养基为基准，进行培养基组成和培养条件的优化．１．２．２　酶活的测定　酶液制备：发酵培养终止后，于４℃、８０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，弃上清液，收集菌体，用磷酸钾缓冲液（０．１ｍｏｌ·Ｌ－１，ｐＨ７．４）洗涤一次，去上清液．离心得到的菌体加入发酵液体积１／１０的磷酸钾缓冲液（ｐＨ７．４）重悬，置于冰浴中，以３ｓ工作、５ｓ间歇超声破碎９０次（２００Ｗ）．破碎后的悬浮液，于４℃、８０００ｒ·ｍｉｎ－１离心２０ｍｉｎ，弃菌体碎片，得酶液用于酶活测定．酶活测定：准确移取５００μｌ酶液于比色皿中，加入２５μｌ１０ｐＮＣＡ（对硝基苯氧基癸酸）（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１），１７２５μｌＴｒｉｓ缓冲液（ｐＨ８．２），混匀，于２５℃保温５ｍｉｎ后，再加入２５０μｌＮＡＤＨ（６ｍｍｏｌ·Ｌ－１），观察记录４１０ｎｍ波长处吸光度的变化．以该条件下，１ｍｉｎ内产生１μｍｏｌ对硝基苯酚盐所需的酶量为一个酶活单位（ε＝１３．２Ｌ·ｍｍｏｌ－１·ｃｍ－１）．１３　实验设计本文将以酶活作为响应目标，采用两步法进行优化，首先利用ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计挑选出对响应影响较大的几个因素，然后再利用响应曲面方法（ＲＳＭ）中的杂合设计进行实验，通过实验数据拟合响应面模型，最终确定最优实验条件，并进行验证．１．３．１　筛选实验———ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计　ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计由Ｐｌａｃｋｅｔｔ和Ｂｕｒｍａｎ于１９４６年提出，它建立在不完全平衡板块原理的基础上，通过犖个实验至多可以研究（犖－１）个变量（犖一般为４的倍数）［１０］．在实验过程中，通常会预留出伪变量作为误差分析．每个变量有高、低两个水平，分别以＋、－标记，在整个ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计中，每个变量取高、低水平的值各犖／２次，而且在某个因素取得高（低）水平时，其·８８１１·化　　　工　　　学　　　报　　第５７卷　他各个因素取得高、低水平各犖／４次．对工程菌产酶产生影响的因素有很多：培养基的组成和ｐＨ直接影响细菌的生长与代谢；Ｐ４５０ＢＭ３由血红素和黄素两个部位组成，发酵时添加适量的Ｆｅ３＋能有效提高产酶量；接种量对菌体的生长有一定的影响，接种量越大，菌体生长越快，延滞期越短，但是菌体生长过快，质粒拷贝数下降，目标蛋白的表达下降；本研究所用的宿主菌对卡那霉素敏感，卡那霉素浓度对细菌生长会产生一定影响；工程菌的目的蛋白表达受ＩＰＴＧ诱导，合适的ＩＰＴＧ浓度可以诱导目的蛋白高效表达，但高浓度的ＩＰＴＧ对细胞代谢有毒性；菌体生长过程中，选择最佳的诱导时机也是一个重要的影响参数，合适的菌体生理状态时诱导可以有效提高产酶量；不同的工程菌表达目的蛋白的诱导温度都不一致；诱导时间对产酶也有较大影响，加入诱导剂后，大量能量消耗在目的蛋白的表达上，使细菌生长提前进入衰亡期，不及时收获会造成溶菌现象以及蛋白被降解现象；摇瓶中的供氧能力与装液量密切相关，而目的基因表达时，细胞需要的大量能量通过有氧代谢提供．鉴于以上原因，在本实验中，确定包括碳源、氮源、ＮａＣｌ、ＦｅＣｌ３、起始ｐＨ、接种量、卡那霉素浓度、诱导剂浓度、诱导时刻、诱导温度、诱导时间、装液量１２个影响因素，选用犖＝１６的ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计，其中３个变量为伪变量．并根据前期预实验结果，采取如表１所示的实验设计，每一行代表一次实验，每一列表示一个考察的参数或伪变量．各参数代表的变量及高低水平对应的真实值见表２．１．３．２　优化实验　响应曲面法是数学方法和统计方法结合的产物，它可以用来对人们感兴趣的受多个变量影响的响应问题进行建模与分析，并可以将该响应进行优化．杂合设计是由Ｒｏｑｕｅｍｏｒｅ［１２］于１９７６年提出的，这种设计可以通过最少的实验来拟合二阶的响应面模型，前几个因素具有５个水平，最后一个因素具有４个水平．本实验所采用的杂合设计是Ｒｏｑｕｅｍｏｒｅ［１２］提出的４１６Ｃ型的设计，具体设计方案如表３所示，各水平对应的变量真实值见表４．１．３．３　验证实验　通过将优化实验所得的实验数据与响应面模型进行拟合，便可以得到模型中的各个系数．再对该多元函数进行简单的性状分析便可确定出其极值点以及取得极值的相应的自变量的取值．再按照计算所得到的参数进行实验，以验证模型的可靠性，并能够确定最后的优化结果．上述每个实验均进行两次，