初稿赤水河流域茅台段土壤宏基因组的提取及检测

赤水河茅台段土壤微生物宏基因组的提取张世冲摘要：赤水河其独特的水质、土壤、气候等自然环境，造就了经典国酒茅台，从赤水河茅台段采集土壤，提取土壤微生物宏基因组，再进行扩增测序，为分析该地区土壤微生物种群结构和筛选出相关的功能基因奠定基础。关键词：赤水河茅台段；土壤微生物；宏基因组迄今,不可培养微生物占据微生物总数的90%以上[1],这使得土壤微生物分子生态学研究受到限制。自然条件下包括病毒在内的微生物通过群落广泛参与CNO和S等重要元素的循环转化在人体的食物消化毒素降解及机体免疫反应环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2],微生物主要是通过其群落而非单一个体来执行这些重要功能，而目前人们对微生物的认识主要基于实验室纯培养的单一微生物物种，对微生物群落作为整体的功能的认识远远落后于对其个体的认识,因此，自1991年Pace首次提出环境基因组学的概念并在同年构建了第一个通过克隆环境样品中DNA的噬菌体文库以来，有关宏基因组学的研究受到广泛关注[3]。宏基因是指在某一时刻某一生活区内所有微生物基因组的总和。利用分子生物学方法从土壤中提取宏基因组,可用于分析这些不可培养的微生物,可用于从土壤中分离以前所不能得到的新型微生物的基因,也可用于分析土壤中微生物的种群多样性和动态变化[4]。赤水河是贵州省仁怀市的母亲河、英雄河和美酒河［5］。茅台酒生态功能保护区位于茅台酒厂上游赤水河河谷地带，地处北纬27．78220°一27．8558°，东经106．2758°一106．3656°，海拔407m—781m，夏季平均气温约28℃［6］。茅台镇四面环山，地势低洼，气候炎热，具有独特的微生物群，因与外界的空气对流循环较缓慢，故微生物种群较稳定。茅台酒的生产用水取自于赤水河，其水质、土壤、小气候环境以及其微生物种群，是酿造茅台酒的重要因素。水的质量直接影响酒的好坏，而土壤又与水质有着极其紧密的联系，本文拟通过对该地区土壤微物赤水河茅台段土壤微生物宏基因的研究来为分析该地区土壤微生物种群结构和筛选出相关的功能基因奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1样品采集本实验所用的土壤样品取自于赤水河流域。1.1.2酶和试剂E.Z.N.A.SoilDNAKit试剂盒购自OMEGABio-Tek公司，其他试剂均为国产分析纯，PCR引物由上海生工合成。1.1.3主要仪器PCR仪为S1000TMThermalCycler（Bio-Rad）,WD-9413A凝胶成像分析仪（北京六一）、EM-259EB1微波炉（三洋）、Miro17RCentrifuge离心机（ThermoScientific）。1.2方法1.2.1土壤微生物DNA的提取与纯化按照OMEGABio-Tek公司E.Z.N.A.SoilDNAKit试剂盒说明略作修改进行提取。称取500㎎GlassBeads加到1.5ml的离心管中，再称取0.5g的实验土壤样品，经过充分研磨后转移至离心管中，然后向管中添加1ml的BufferSLXMlus,涡旋震荡3min,再向离心管中加入100μlBufferDS,涡旋2min。将离心管放在温度为90℃的水浴锅中10min，水浴完后，室温3000r/min离心3min，收集上清液800μl至新的2ml的离心管中，再向其中添加270μlBufferSP2，涡旋1min，然后在冰上孵育5min，孵育完后，在4℃下13000r/min离心5min，吸取上清液转移至新的2ml离心管中，然后加0.7倍上清液的冷异丙醇，混匀，放入-20℃冰箱中孵育1h，然后在4℃下13000r/min离心10min，小心倒掉上清液，将离心管倒置在吸水纸上1min。加200μlElutionBuffer（提前放在70℃水浴锅中水浴）到管中涡旋10s，70℃下水浴15min，加50μlHTRReagent涡旋10s，室温放置2min，然后在室温下13000r/min离心2min，吸取上清液转移至新的2ml离心管中，加入等体积的XP2Buffer，涡旋。将样品转入HiBindDNAMiniColumn，并放入2ml的收集管，室温10000r/min离心1min，倒掉收集管中的液体，重新使用收集管，向HiBindDNAMiniColumn中加入300μlBufferXP2，室温10000r/min离心1min，倒掉液体，扔掉收集管，将HiBindDNAMiniColumn放入新的2ml的收集管中。向HiBindDNAMiniColumn中加700μlSPW·washBuffer（提前用无水乙醇稀释），室温10000r/min离心1min，倒掉收集管中的液体，重复上述步骤一次，将DNAMiniColumn放入新的收集管中，室温13000r/min离心2min。将HiBindDNAMiniColumn放入1.5ml的离心管中，加入50μlElutionBuffer（提前放在70℃水浴锅中水浴），在65℃水浴15min，水浴完后，室温13000r/min离心1min，重复上述步骤一次。仍掉HiBindDNAMiniColumn，将离心管中液体放-20℃保存。1.2.2电泳分析采用1%的琼脂糖凝胶，用GoldViewⅠ作为指示剂，TBE作电泳缓冲液进行电泳。1.3PCR扩增与分析1.3.1反应体系与程序反应体系：引物1、2各0.5μl，dNTP2μl，10×TaqReactionBuffer2.5μl，MgCl21.5μl，Taq酶0.5μl，模板1μl，ddH2O16.5μl，总体积25μl。反应程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，53℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环,最后72℃延伸10min。1.3.2PCR的分析用1%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。1.4序列测定与分析将PCR的产物寄送往公司进行序列测序。序列分析通过//软件进行。2结果与分析2.1土壤宏基因组的提取由图1可知所得宏基因组的分子量大于2000bp，且条带相对清晰，表明效果不错。2.2PCR扩增↓对提取的土壤宏基因进行PCR扩增，然后进行PCR扩增分析。由图2可知提取的土壤宏基因组出现的是大小为1800bp左右的扩增产物，这说明已经得到了PCR扩增级别纯度的土壤宏基因组。2.3对扩增产物进行测序测序结果如图3所示。1231232000bp-----2000bp------1000bp------图1土壤宏基因组电泳图图216SrDNA基因扩增产物电泳分析Fig.1Theelectrophoresispatternofsoilmetagenome1.分子量标准；2.样品1；3.样品2Fig.2PCRamplificationpatternofthe16SrDNAfromsoilmetagenome.1.分子量标准；2.样品1；3.样品23讨论由于土壤本身和其中微生物的复杂性，常规分析微生物的方法如平板计数、生物量测定等方法准确性收到极大的限制。从土壤宏基因组的角度研究其多样性及功能是一种可行的方法，并已在国内外收到广泛关注［7］。要构建土壤宏基因组文库需要从土壤中提取高质量的DNA。从土壤中提取宏基因组的方法可以分为两类:一是直接法(细胞原位裂解)即在土壤中直接裂解微生物菌体,再提取基因组；另一类是间接法(细胞回收)即先将微生物菌体与土壤颗粒分开,再提取基因组。用直接法提取尽管得到的DNA中包含的腐殖酸、粘粒和多糖等抑制物的量较高，但DNA的含量也相对较高，所以此次实验采用的是直接法。在对土壤DNA提取时，刚开始使用的步骤完全是按照OMEGABio-Tek公司E.Z.N.A.SoilDNAKit试剂盒提供的步骤进行操作，但是提取了2次都没有结果，后来对其中二个实验步骤的条件进行了改变：一是向样品中加入100ulBufferDS后放入90℃（提供的步骤中是70℃）的水浴锅中加热，以此使难溶的细菌溶解；二是加入冷的异丙醇后放入冰箱3h（提供的步骤中是1h），以此使更多的DNA沉淀。在跑电泳时，刚开始得到的条带模糊弥散，而且DNAMarker条带没有分开，后来更换了缓冲液，再次电泳得到了清晰的条带，可见缓冲液在多次使用后，其缓冲效果会有影响。参考文献[1]AmannRI,LudwingE,SchleiferKH.Phylogeneticidentificationandinsuitdetectionofind-ividualmicrobialcellswithoutcultiviation[J].MicrobiolRev,1995,59:143~169.[2]WhitmanWB,DCColeman,WJWiebe.Prokaryotes:Theunseenmajority[J].ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(12):6578-6583.[3]贺纪正，张丽梅，沈菊培，等．2008．宏基因组学(Metagenomics)的研究现状和发展趋势[J]．环境科学学报，28(2)：209—218.[4]TorsvikV,GoksoyrJ,DaaeFL.HighdiversityinDNAofsoilbacteria[J].ApplEnvironMicrobio,1990,56(3):782~787.[5]邹凤钗，董泽琴，王海鹤，等．赤水河中段水环境质量现状[J]．中国人口·资源与环境，2010，20(3)：368—371.[6]范光先，吕云怀．保护国酒传统知识产权——建立茅台酒工业生态功能保护区[J].酿酒，2004，31(3)：1-3.[7]VigdisT,LiseO.Microbialdiversityandfunctioninsoilfromgenestoecosystems[J].Ecologyandindustrialmicrobiology,2002,5:240~245.[7][8][10]