内毒素耐受和胆碱能受体兴奋对巨噬细胞贮存和分泌TNFα的影响

内毒素耐受和胆碱能受体兴奋对巨噬细胞贮存和分泌TNFα的影响解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所吕艺周国勇胡森【摘要】目的探讨内毒素耐受和拟胆碱药物卡巴胆碱对巨噬细胞TNFα分泌的调节作用。方法①分离小鼠腹腔巨噬细胞，将其与LPS作用不同时间；②小鼠腹腔巨噬细胞分为三组：空白对照组（RPMI1640常规培养），LPS耐受+刺激组（LPS预刺激20h,再用LPS刺激4h）和LPS刺激组（RPMI1640常规培养20h后，再加LPS刺激4h）；③分离大鼠腹腔巨噬细胞，分为三组：空白对照组、LPS刺激组及卡巴胆碱预处理后LPS刺激组。收集各组细胞培养上清液及细胞裂解液，用ELISA方法检测TNFα浓度。结果LPS预刺激巨噬细胞20h后再次用LPS刺激时，其TNFα分泌量不增加，与对照组接近，同时细胞内TNFα含量也不增加。未经LPS预刺激的巨噬细胞在受到LPS刺激后TNFα分泌量大幅增加，同时细胞内TNFα含量也伴随增加，即细胞分泌和贮存的TNFα量变化一致。卡巴胆碱预处理巨噬细胞受内毒素刺激后TNFα分泌量低于单纯内毒素刺激组细胞，但细胞内的TNFα含量高于对照组，与单纯内毒素刺激组接近。结论巨噬细胞建立内毒素耐受机制或受到拟胆碱药物作用后，再次受到LPS刺激后均表现为TNFα分泌的减少，但细胞内TNFα量变化规律不一致。提示内毒素耐受和胆碱能抗炎所致巨噬细胞炎症反应特性改变的机制不同。【关键词】巨噬细胞；内毒素耐受；拟胆碱药；肿瘤坏死因子【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedifferenceofregulatingTNFαsecretionbetweenendotoxintoleranceandcholinergicdrug--carbacholpre-treatedmacrophages.Methods①theperitonealmacrophageswereobtainedfrommalemice,whichwereexposuretoendotoxin(LPS)for0,2,4,and8hours;②theisolatedperitonealmacrophagesweredividedinto3groups:control(RPMI1640routineculture),LPSpre-treatment(pre-exposuretoLPSfollowedbyLPSstimulation,andLPSstimulation;③theperitonealmacrophagesofratswereisolatedandweredividedinto3groups:Control,LPSstimulation,andcarbacholpre-treatment(LPSstimulationfollowingpre-exposuretocarbachol)groups.LysateofmacrophagesinexperimentandcellsupernatantsinallexperimentswereharvestedtodeterminedthecontentofTNFαbyELISAmethod.ResultsTheamountofTNFαsecretioninLPSpre-treatedmacrophageswasnotincreasedfollowingstimulatedwithLPSagain,andnodifferencewasobservedbetweenLPSpre-treatedandcontrolgroups.NoincreaseinTNFαcontentwasobservedinLPSpre-treatedmacrophages.ButfortheLPSuntreatedmacrophages,theamountofsecretedTNFαwasincreaseddramaticallyandaccompaniedwiththeincreaseofTNFαcontentinthemacrophagesafterbeingstimulatedbyLPS,namelybothsecretedandreservedTNFαweresignificanthigh.Forcarbacholpre-treatedcells,theamountoftheirsecretingTNFαwaslowerinthanthatofcarbacholuntreatedcells,butthecontentofTNFαincellswashigherthanthatinthecontrol,anditwasclosetothatintheLPSstimulatingcells.ConclusionAfterbeingstimulatedbyLPS,bothendotoxintolerantandcholinergicpre-treatedmacrophagesreducedtosecreteTNFα,butthevariationofTNFαcontentinthetwogroupswasoutofaccord.Itissuggestedthatinmacrophages,themechanismsofinflammatorychangeinducedbyendotoxintoleranceandcholinergicantiinflammationaredifferent.【Keywords】macrophage;endotoxintolerance;cholinergic;tumornecrosisfactor-α尽管对于感染性疾病的治疗手段已经有了长足的进步，然而，脓毒症仍然是世界范围内主要的死亡原因之一[1，2]。来源于革兰氏阴性细菌的内毒素（lipopolysaccharide,LPS）是脓毒症的主要启动因素[3]。在脓毒症的发生、发展过程中，内毒素作用主要有两方面：一是诱导失控的炎症反应[4]，大量分泌的炎症介质导致免疫亢进、组织细胞坏死及脏器功能衰竭；另一个重要机制是内毒素能够诱导单核巨噬细胞对内毒素本身的不反应状态，又称为“内毒素失敏”或“内毒素耐受”[5]。动物实验观察到，给与低剂量内毒素预处理，可明显降低随后给与致死性内毒素打击的动物死亡率[6]，这是内毒素耐受机制建立后，对机体有利的一面；另一方面。内毒素耐受可以导致“免疫抑制”[7]，这也是部分脓毒症晚期病人重要的死亡原因之一。因此，研究内毒素耐受机制将有助于我们寻找防治脓毒症的新策略。胆碱能抗炎通路的提出，为脓毒症及其它以失控炎症反应为特征的疾病提供了一种新的防治理念。细胞和动物实验均显示，胆碱能药物能够有效地抑制炎症性细胞因子的表达和释放[8，9]，具有与巨噬细胞内毒素耐受相似的效应。在本研究中，我们比较了内毒素耐受和拟胆碱药卡巴胆碱预处理巨噬细胞的肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor–α，TNFα）分泌量和细胞内含量的异同，旨在为防治脓毒症和失控炎症反应相关疾病提供更合理、有效的策略。1材料与方法1.1动物及巨噬细胞的获取清洁级雄性Wistar大鼠，180-220g；清洁剂6雄性昆明小鼠，18-22g。动物均购自协和医科大学实验动物中心。动物在本实验室适应一周，纳入实验。饲养条件：22-25℃，12h光照/12h黑暗。实验前12h禁食，自由饮水。脱臼法处死动物后，浸入70%乙醇中消毒。固定四肢，剪开腹部皮肤，钝性分离至暴露出腹膜壁。碘伏和75%酒精消毒腹膜壁，注射器吸RPMI1640从腹白线处注入腹腔中（大鼠20ml。小鼠5mlX2次），轻揉腹壁后，吸出灌洗液，注入无菌离心管中。4℃，250g离心10分钟后，弃上清，加RPMI1640培养液（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素），将细胞打散。计数细胞，将细胞调整至106细胞/ml。胎盼蓝染色观察细胞活力在95%以上。将细胞悬液加入24孔培养板中，1m/每孔，置37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育2小时。除去培养液，PBS洗细胞2次，RPMI1640洗1次，去除非贴壁细胞。再加新RPMI1640（含10%FCS）。根据不同实验要求做相应处理。1.2实验分组及处理1.2.1卡巴胆碱对LPS刺激巨噬细胞分泌TNFα的影响上述所取大鼠腹腔巨噬细胞，调整浓度为106细胞/ml。在24孔培养板中，每份细胞加入3孔，每孔加入1ml；3孔细胞分别进入3组：对照组、LPS刺激组、卡巴胆碱+LPS刺激组。加入卡巴胆碱终浓度为20μmol/L，在加入LPS前15min加入；加入LPS终浓度为100ng/ml。1.2.2LPS耐受对巨噬细胞分泌TNFα的影响上述所取小鼠腹腔巨噬细胞分为三组：空白对照组（RPMI1640常规培养），LPS耐受+刺激组（LPS预刺激20h,再用LPS刺激4h）和LPS刺激组（RPMI1640常规培养20h后，再加LPS刺激4h）。LPS作用的终浓度为100ng/ml。1.2.3LPS作用不同时间的腹腔巨噬细胞分泌TNFα的规律在24孔板中，每份细胞加入4孔；在相应时间点，每孔加入LPS（终浓度为100ng/ml），分别作用0h，2h，4h，8h，收集培养上清，测定TNFα浓度。1.2.4细胞裂解液的制备各组细胞培养终点，吸取培养上清液后，用PBS洗细胞3次；加入非变性蛋白裂解液0.5ml/孔，反复吹打，置冰浴中20min，转至样本管中，-20℃冻存。1.3TNF浓度的检测采用ELISA方法测定细胞培养上清液和细胞裂解液中TNFα水平。1.4统计学分析实验数据以均数±标准差表示，用SPSS12.0对数据进行成对资料的t-检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1LPS刺激时间对巨噬细胞分泌TNFα的影响图1结果显示，用100ng/ml的LPS刺激巨噬细胞不同时间，TNFα的分泌量增加；以刺激后4h时间点增加幅度最大，8h点有所回落。TNF(pg/ml)02004006008001000120014000h2h4h8h图1LPS刺激巨噬细胞不同时间TNFα分泌量的变化（n=6）2.2LPS耐受对巨噬细胞TNFα分泌量和细胞内含量的影响体外正常条件下培养的巨噬细胞仅分泌少量TNFα；给予LPS刺激20h，培养上清液中TNFα含量大幅增加。然而，当以LPS再次刺激LPS预处理20h的巨噬细胞（LPS耐受细胞）时，可以发现其TNFα含量远远低于未经LPS预处理的巨噬细胞（图2），这部分细胞即为LPS不耐受巨噬细胞。同时看到，细胞裂解液中TNFα含量与细胞培养上清液中TNFα的含量变化规律一致。进一步分析数据可以发现，LPS不耐受细胞裂解液中TNFα增加的比例远高于培养上清液增加的比例，而LPS耐受的细胞在受到同样剂量的LPS刺激同样的时间后，却不出现细胞内TNFα的增加（图3）。TNF（pg/ml)020406080100120对照LPS耐受LPS不耐受*#TNF（pg/ml)0100200300400500600对照LPS耐受LPS不耐受*#图2LPS刺激对巨噬细胞TNFα分泌的影响(n=6)图3LPS刺激对巨噬细胞中TNFα含量的影响(n=6)*p0.05(与LPS耐受组比较),#p0.01(与对照组比较)*p0.05(与LPS耐受组比较)#p0.05(与对照组比较)2.2卡巴胆碱对巨噬细胞TNFα分泌量和细胞内TNFα含量的影响图4结果显示，给予卡巴胆碱预处理的巨噬细胞，当受到LPS的刺激时，尽管其培养上清中TNFα含量也增多，但增加的幅度显著低于未经卡巴胆碱预处理的细胞培养上清（p0.01）（图4）。同时测定细胞裂解液的TNFα可以发现，卡巴胆碱预处理细胞的TNFα含量与LPS不耐受的细胞同样表现为较大幅度的增加（p0.05）（图5）。TNF(pg/ml)0500100015002000250030003500400045005000对照组Car+LPS组LPS刺激组**#05