伽马氨基丁酸的测定

操作要点:选取籽粒饱满的稻米，去皮后用Pearlest精米机处理40s成为精米。为了抑制发芽后的发酵味，用1%的次氯酸钠水溶液洗1min，用灭菌的去离子水反复冲洗3遍。将处理好的精米用纱布包好，恒温浸泡，转入培养皿中发芽，保持培养皿湿润，每3h上下翻动一次。发芽结束后将培养皿放入55℃烘箱终止活性，干燥一定时间，取出粉碎。1.2.2GABA含量测定样品准备:将粉碎后的样品过60目筛，称取2g，加入5%三氯乙酸水溶液5mL，30℃振荡提取2h，离心(转速10000r/min)10min，取上清液待测色谱条件:单泵，流速为0.9mL/min;色谱柱为VenusilMP－C18(4.6×250mm)，柱温30℃;流动相为1.6gNaAc·3H2O溶于600mL水中，pH7.2，甲醇200mL，乙氰200mL;检测波长338nm。衍生化:吸取硼酸缓冲液(0.4mol/L，pH10.4)1000μL，样品200μL，OPA衍生试剂(OPA80mg，β－巯基乙醇80μL，乙腈10mL)200μL，混合均匀，暗室中室温反应5min后进样20μL。GABA标准曲线的绘制:用配制好的250mg/L的标准液分别稀释50、40、30、20、10、6、5倍，柱前衍生，吸取20μL进样，重复三次，以GABA的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。衍生试剂（邻苯二甲醛OPA）的配制０．５Ｍ硼酸钾溶液：称取３．１０００ｇ硼酸，２．６０００ｇ氢氧化钾于烧杯中，用双蒸水溶解，定容于１００ｍＬ容量瓶中，摇匀，用硝酸调节ｐＨ到９．５邻苯二甲醛（ＯＰＡ）溶液：称取０．３０００ｇＯＰＡ，溶解于５ｍＬ甲醇，再溶解于１００ｍＬ０．５Ｍ硼酸钾溶液中，然后加入０．２５ｍＬ２－巯基乙醇［１９］，混匀，避光４℃冰箱中保存（最多可保留１周，最好现配现用）γ-氨基丁酸的分离提取米糠中加入3～5倍体积0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)，37℃水浴电动搅拌抽提4h，减压抽滤，以4000r/min离心30min，取出上清加入10%磺基水杨酸离心弃沉淀，冷冻干燥后为黄粽色固体，将其溶解于蒸馏水中、上SephadexG-25层析柱(1.5×74cm)分离，蒸馏水洗脱，收集与茚三酮溶液反应呈阳性的洗脱液，浓缩，GABA定性检查，所得样品调节pH值约为4，上磺酸型阳离子交换柱(2.0×30cm)，冰乙酸一吡啶缓冲液进行pH线性梯度洗脱，收集含GABA洗脱液，浓缩，硅胶H薄板层析鉴定。1.2.2γ-氨基丁酸含量的测定比色法按Tsushida中的方法[3]略加以改进；取样液300μl，加0.2mol/LpH10.0硼酸盐缓冲液200μl，6%重蒸酚100μl，混匀后再加入0.8ml5%NaClO溶液，振荡。于沸水浴中加热10min后置冰浴5min，待溶液出现兰绿色后，加入2.0ml60%乙醇溶液，于波长645nm处比色，并以已知浓度标准GABA溶液绘制标准曲线仪器测定方法；用日定-838-50型氨基酸自动分析仪测定。硅胶H薄层层析，按文献[4]方法进行[4]朱俭,曹凯鸣,周润崎,等.生物化学实验[M].上海:上海科技出版社,1981.43-45.从米糠中提取γ-氨基丁酸条件实验米糠分别用0.01mo/LpH5.0、pH6.0柠檬酸缓冲液、0.01mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液及蒸馏水抽提，测定比较在不同温度(25、37、50、60℃)条件下，不同搅拌抽提时间(0.5、2、4、6h)，米糠提取液中γ-氨基丁酸的含量及水提取液中氨基酸的组成及含量分析。