免疫组化步骤

第一部分Cathelicidin(LL-37)与COPD患者小气道重塑和肺气肿病理改变关系的研究1.1前言小气道重塑和肺气肿是COPD的两大主要病理改变。小气道管腔狭窄、闭塞以及气道壁的增厚导致气道阻力增加;肺实质的破坏导致肺弹性回缩力下降，两者的共同作用导致了气流受限。目前，小气道重塑和肺气肿的发病机制尚不明确，研究表明，多种炎症因子(IL-8,IL-1p,TNF-a)、生长因子(TFG-p、EGF)和酶(MMP-8,MMP-9)·等参与了COPD小气道重塑和肺气肿的发病过程。AMPs具有广谱抗病原微生物的作用，广泛分布于呼吸道的上皮细胞和炎症细胞中，在呼吸系统天然免疫过程中发挥重要作用。随着研究的不断深入，人们发现具有多种生物学效应的AMPs可能参与了COPD小气道重塑和肺气肿的发病粗过程。文献报道COPD患者痰液和肺泡灌洗液中a防御素HNP1-3水平明显升高，与肺功能指标FEV1%和FEV1/FVC显著负相关，与炎症指标IL-8水平显著正相关，提示a防御素与COPD的发病关系密切[[32,33]。进一步研究证实，a防御素可促进气道上皮细胞增殖，并通过p一连环蛋白通路促进肺成纤维细胞增殖和胶原分泌[34,351，上述结果表明a防御素可能在COPD小气道重塑的发病中扮演董要角色。我们的前期研究发现，COPD患者诱导痰中LL-37的表达显著增高[[13,161，与炎症指标IL-8水平显著正相关，体外研究表明，LL-37可促进支气管上皮细胞(BEP-2D)炎性因子IL-8和TNF-a的释放，并诱导气道上皮细胞(BEP-2D)及肺泡上皮细胞(A549)的凋亡，提示LL-37可能参与了COPD气道炎症和肺气肿的发病过程。进一步病理研究显示，COPD患者小气道上皮细胞和肺泡上皮细胞中LL-37的表达显著高于非COPD对照组[[161，然而LL-37与COPD小气道重塑和肺气肿两大病理改变的关系尚不明确。因此，我们采用免疫组织化学染色法检测COPD患者肺组织LL-37的表达情况，并进一步分析LL-37与COPD患者肺组织小气道重塑和肺气肿病理改变的关系。1.2材料与方法1.2.1材料1.主要仪器主要仪器及型号:肺功能仪石蜡包埋机石蜡切片机全自动脱水机烤片机电热恒温鼓风干燥箱微量移液器光学显微镜2.主要试剂主要试剂兔抗人LL-37多克隆抗体免疫组化检测试剂盒DAB显色试剂盒天狼猩红染色剂饱和苦味酸无水乙醇二甲苯3.主要溶液配制:(1)0.1MPBSNaCl80gNa2HP04-12H2032.3gNaH2P04-2H204.5g溶于800M1去离子水中，用1M的NaOH调PH至7.2，加去离子水定容至1OOOMIo(2)10%中胜甲醛溶液40%甲醛1Oml,0.01MPBS90m1，充分混匀，室温保存。(3)构椽酸缓冲液:A液:构椽酸(C6H807.H20)21.01g加水定容至1OOOMIoB液:构椽酸钠(C6H5Na307.2H20)29.41g加水定容至1OOOMI0使用时，9mlA液，41mlB液，加去离子水至450m1，调PH至6.0，配制成工作液。(4)DAB工作液50,1DAB浓缩液稀释至1创DAB缓冲液中，混合均匀，配置成DAB工作液，此溶液现用现配，避光保存。(5)天狼猩红饱和苦味酸染色液称取1.0g天狼猩红粉末，加入饱和苦味酸，定容至1L，常温保存。3.组织处理及包埋手术切除肺叶后，选取远离病变边缘:)CM.以上的肺组织，经10%中性甲醛固定24h。将固定好的组织标本用流水反复冲洗24h--50%酒精8h-*75%酒精8h-85%酒精5h--*95%乙醇15h-95%乙醇II5h、无水乙醇I1h、无水乙醇111h--+二甲苯I0.5h-+二甲苯110.5h-60℃烘箱中浸蜡1h包埋*4℃冰箱保存备用。4.切片、展片、粘片修整蜡块，调节石蜡切片机切片厚度为5.0gm，连续切片，置于60℃温水漂浮展平，平铺于涂有阳离子树脂的载玻片上，60℃烤箱中烘干。5.HE染色及形态学测量(1)HE染色肺组织切片置于60℃恒温鼓风干燥箱中烤片50min后放入二甲苯中脱蜡至水(二甲苯I15min---二甲苯II15min---无水乙醇I10min---无水乙醇II10min---95%乙醇5min---85%乙醇5min---75%乙醇5min)，自来水反复冲洗5min，置于苏木精液染色7min，自来水冲去浮色，0.5盐酸酒精分化30s，双蒸水洗3次，1%氨水返蓝，自来水冲洗，0.5%伊红复染1min，双蒸水冲洗，梯度酒精脱水透明(75%乙醇10min---85%乙醇5min---95%乙醇5min---无水乙醇I10min---无水乙醇II10min---二甲苯I15min---二甲苯II15min)，中性树胶封固成片，盖玻片封片后放入切片盒保存备用。(2)形态学测量HE染色后，光学显微镜下观察肺组织小气道区和肺泡区的病理改变，应用Image-ProP1us5.0图像分析软件测量下述指标:①气道壁厚度:选取直径2mm的小气道，测定气道基底膜周长(Pbm)和气道壁总面积(WAt)，计算WAt/Pbm2，反映小气道壁厚度。②平均内衬间隔(meanlinearintercept,MLI):每张切片随机选取8个视野，测量时避开支气管及血管，在每个视野正中心划“十”字交叉线，计数单位长度交叉线的肺泡隔数，该指标反映平均肺泡直径大小。③平均肺泡数((meanalveolarnumbers,MAN):单位面积视野内的肺泡数目，该指标反映肺泡密度。6.天狼猩红染色及形态学测量:(1)天狼猩红染色肺组织切片置于60℃恒温鼓风干燥箱中烤片50min、石蜡切片常规脱蜡至水(同HE染色)*苏木素液染色3min*流水冲洗2min--1盐酸一乙醇分化is*流水冲洗*1%氨水5s、流水冲洗1mince蒸馏水洗1min-+0.l%天狼猩红饱和苦味酸染液lh*无水乙醇分化lOs一梯度酒精脱水透明(同HE染色)*中性树胶封片。(2)形态学测量天狼猩红染色后，偏振光显微镜下观察并采集图像，使用Image-ProPlus5.0图像分析软件测定以下指标:①小气道区胶原沉积:随机选取小气道区4个视野，测量气道基底膜周长(Pbm)和气道壁周围胶原面积(WAc)，计算WAc/Pbm，反映小气道壁周围胶原沉积情况。②肺泡区胶原含量:根据文献[37]的方法，测量肺泡区胶原的积分光密度和面积，用平均光密度(积分光密度/面积)表示肺泡区胶原的含量。7.免疫组化法检测肺组织中LL-37的表达(1)石蜡切片置60℃恒温鼓风干燥箱中烘烤50min;(2)肺组织切片常规脱蜡至水(同HE染色);(3)PBS洗3次，每次5min;(4)3%H202孵育10min;(5)PBS洗3次，每次5min;(6)抗原修复:将肺组织切片置于构椽酸缓冲液工作液中，微波修复15min,保证液体温度在92℃-97℃之间，冷却至室温;(7)PBS洗3次，每次5min;(8)滴加兔抗人LL-37抗体50ul(稀释度为1:300)，同时作PBS阴性对照，4℃过夜。(9)PBS洗3次，每次5min。(10)滴加PV-9001兔超敏二步法免疫组化检测试剂1(聚合物辅助剂，PolymerHelper)，370C孵育30min;(11)PBS洗3次，每次5min.(12)滴加PV-9001兔超敏二步法免疫组化检测试剂2(辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体，PolymerPeroxidase-anti-RabbitIgG)，室温孵育25min;(13)滴加DAB工作液50ul，镜下观察1-5min;(14)去离子水终止染色，自来水冲洗;(15)苏木素复染3min,1%盐酸酒精分化10s，流水冲洗10min.(16)经梯度酒精脱水，二甲苯透明。(17)中性树胶封片。8.阳性结果判定LL-37染色反应阳性表现为细胞胞质棕黄色颗粒样染色，采用Image-ProPlus5.0软件分析小气道区和肺泡区LL-37的表达情况:(1)小气道区:选取内径2mm的小气道，计算小气道上皮细胞LL-37的平均光密度值(积分光密度/面积)和小气道粘膜下层阳性细胞数(阳性细胞数/粘膜下面积);(2)肺泡区:计算肺泡区LL-37的平均光密度值。1.2.3数据统计本文所有数据由SPSS16.0软件进行分析，所测数据用平均值士标准差表示，组间的比较采用非参数统计Mann-WhitneyU检验和Kruskal-WallisU检验，关联性分析采用Spearman等级相关分析。P0.05认为差异有统计学意义。