产气荚膜梭菌Bata2毒素小鼠多克隆抗体的制备及检测

产气荚膜梭菌Bata2毒素小鼠多克隆抗体的制备及检测产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens),是一种革兰氏阳性、产芽孢、杆状厌氧菌,广泛分布于自然界和多种动物肠道内,在一定条件下,可引家畜、野生动物和人类的多种疾病。该菌按照产生的毒素不同可分为五种血清型(A、B、C、D和E型)。由于该菌的致病性与其产生的毒素有关,因此按照细菌产生的主要毒素进行定型,对本病的诊断和流行病学监测就显得非常重要。本研究通过显微镜观察、血清中和试验、生化试验和PCR方法分离和鉴定了一株家畜体内的产气荚膜梭菌；建立了检测产气荚膜梭菌毒素的多重PCR诊断方法、荧光定量多重PCR方法和单克隆抗体夹心ELISA方法；其中用荧光定量PCR方法从家畜粪样中直接检测梭菌毒素,在国内尚属首次。另外,通过寡核苷酸介导的突变方法,在国内首次构建了产气荚膜梭菌ε毒素的一个无细胞毒性突变体,并用该突变体蛋白做了小鼠免疫保护试验。研究结果如下：(1)从宁夏某奶牛场急性死亡的奶牛组织和肠道中分离出一株细菌,该菌在厌氧条件下生长迅速,产酸产气：在鲜血琼脂平板培养基上,菌落为圆形、扁平光滑、边缘呈锯齿状以及周围有双溶血环。经生化试验、小鼠血清中和试验以及PCR检测最终鉴定为A型产气荚膜梭菌,并且将α毒素进行了克隆表达。(2)建立了多重PCR检测产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因的检测方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,用本方法检测多种细菌,只有产气荚膜梭菌呈现阳性反应,而其它梭菌以及大肠杆菌、葡萄球菌均为阴性；将目标菌的肉汤培养液样品10倍系列稀释后进行检测,检测灵敏度达到1.2×103CFU／mL.用该方法可以检测动物粪便样品和肠内容物中的产气荚膜梭菌并直接确定其血清型,为产气荚膜梭菌临床诊断和分子流行病学调查提供了可靠的技术。(3)试验中制备了三株分泌抗产气荚膜梭菌a毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5A4、3H4和5H4,对它们的部分特性进行了鉴定,单抗亚型鉴定结果显示5A4、3H4和5H4抗体亚型分别为IgG1、IgG1和IgG2a。杂交瘤细胞经小鼠多次传代后进行效价检测,结果三株单抗都具有很好的稳定性。用5A4初步建立了单抗夹心ELISA方法,为产气荚膜梭菌a毒素的大量检测奠定了基础。(4)参考发表的序列建立了检测产气荚膜梭菌毒素基因的荧光定量多重PCR方法,该方法可直接从动物粪样中检测目标菌的毒素基因并对目标菌定型。在实验室对宁夏地区三个奶牛场采集的261份粪样用本方法检测。结果发现,261份样品中有176份样品存在产气荚膜梭菌毒素基因,根据毒素分型规则判断只有A型和D型产气荚膜梭菌,在176份阳性样品中有142份样品中含有cpb2基因,占总数的80.7%。利用荧光定量多重PCR方法对奶牛粪样中产气荚膜梭菌分子进行定型,这在我国是首次报道。(5)实验中克隆和表达了D型产气荚膜梭菌e毒素基因,并且采用寡核苷酸介导的突变方法,在国内首次构建了产气荚膜梭菌e毒素的一个突变体,突变体蛋白能在大肠杆菌(Rosseta)中获得表达,并且表达的蛋白能够被天然e毒素抗体所识别。用体外MDCK细胞分析法检测了此突变体蛋白的细胞毒性,结果表明,当e毒素蛋白第106位的组氨酸突变为脯氨酸后毒素蛋白的细胞毒性丧失,用此蛋白免疫小鼠后能产生特异性抗体,并且免疫小鼠能够抵抗1000LD50剂量的野生型e毒素攻击。该实验为进一步研究D型产气荚膜梭菌e毒素结构与功能的关系以及研制预防动物肠毒血症的基因工程疫苗奠定了基础。C型产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)，又称魏氏梭菌(C1welchii)是一类重要的人兽共患病的病原体，是引起动物出血性、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌，易导致新生幼畜和幼禽(尤其新生仔猪)高致病性和高病死率。长期以来一直认为C型产气荚膜梭菌只产生主要的毒力因子α和β毒素(现称β1毒素)，并做了许多研究［1-5］。近年来又发现另一种毒力因子即β2毒素［6］。免疫佐剂是与抗原混合注射于动物体内，能非特异性的改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答的一种物质。本实验将含α-β2-β1融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)优化［7］后，进一步制备抗原，并配以氢氧化铝胶体作为免疫佐剂，免疫ICR小白鼠，再用C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2外毒素攻毒，观察免疫保护情况。1材料与方法1.1菌株基因工程菌株BL21(DE3)(PXETAB2BZ)系作者［8］构建和保存；C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2由西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室保存。1.2实验动物18～20gICR小鼠(雌雄各25只)购于宁夏医学院实验动物中心(合格证号SCXK(宁)2005-0001)。1.3氢氧化铝胶体免疫佐剂的制备氢氧化铝200g，氯化钠8.5g，蒸馏水加至1000mL，完全混合均匀后双层纱布过滤2次，1.05×105Pa高压灭菌60min备用。1.4菌种的复壮在预先准备好的含50mg/mLKan的LB平板上，接种环划线冻存的BL21(DE3)(PXETAB2BZ)菌种，倒置于37℃培养箱中培养12～16h后，挑取单个菌落，接种于含50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃振荡培养12～16h后备用。1.5免疫用抗原的制备1.5.1包涵体粗提物抗原的制备将IPTG诱导5h的50mL培养物离心收集菌体，然后重悬于0.5mL1%Tris-HCl-2mmol/LEDTA中，加入溶菌酶至终浓度100μg/mL，再加入0.5mL1%TritonX-100，于30℃温浴15min。超声波处理10s后再超声波处理10s，12000r/min离心15min，收集的沉淀物即为包涵体粗提物。将该包涵体重溶于20mL的生理盐水中，超声波处理10s后再超声波处理10s，12000r/min离心15min，收集沉淀重溶于6mL的生理盐水中，分装于6支离心管中，备用。将制备的包涵体粗提物1支用灭菌生理盐水10倍稀释后，加入氢氧化铝凝胶至终浓度10%，经无菌检验后作为免疫用抗原。1.5.2重组菌全细胞培养物抗原的制备挑取LB平板的单个菌落，接种于5mL含30μg/mLKan的LB试管中，于37℃振荡过夜。次日取1mL接种于100mL含Kan的LB三角瓶中(1%接菌量)，于37℃振荡16～24h后加入0.8%甲醛灭活3d后，取50mL按10%加入氢氧化铝凝胶佐剂，经无菌检验后作免疫用抗原。1.6免疫接种实验取小鼠50只，随机分成5组，每组10只(每组雌雄各5只)，第一组和第二组皮下注射用包涵体加铝胶制备的抗原(0.5mL)，第三组和第四组皮下注射含工程菌全细胞培养物加铝胶制备的抗原(0.5mL)，第五组皮下注射生理盐水(0.5mL)作为对照。间隔14d进行二免。二免14d后用C型产气荚膜梭菌强毒株(C59-2)进行攻毒，每天观察小白鼠死亡情况。1.7C型产气荚膜梭菌毒素的制备将C型产气荚膜梭菌强毒株(C59-2)接种于肝片肉汤厌氧培养基中，37℃过夜培养，4℃5000r/min离心20min后以0.44μm微孔滤膜过滤除菌，即为毒素粗提物，临用前以无菌生理盐水稀释10倍，作为攻毒毒素。1.8C型产气荚膜梭菌作用于ICR小鼠LD100的测定将毒素粗提物用灭菌生理盐水稀释10倍后以不同剂量(0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mL)分别腹腔注射6组ICR小鼠，每组4只(每组雌雄各2只)，48h后观察各组小鼠的死亡情况，确定ICR小鼠LD100。1.9攻毒试验将C型产气荚膜梭菌毒素粗提物以1LD100剂量对第一和第三组免疫小鼠进行攻毒，以2LD100剂量对第二和第四组免疫小鼠进行攻毒，同时以1LD100剂量注射对照组小鼠，48h后观察各组小鼠死亡情况，观察免疫保护效果。2结果2.1C型产气荚膜梭菌毒素LD100的测定由表1可以确定C型产气荚膜梭菌强毒株(C59-2)毒素对ICR小鼠的LD100为0.005mL(C59-2毒素原液剂量)。表1C型产气荚膜梭菌毒素LD100测定（略）表2免疫原性实验结果（略）2.2重组菌株的免疫原性实验3讨论C型产气荚膜梭菌属腐生性厌氧芽胞致病菌，在土壤中广泛存在，享有广泛的疫源地，因而对我国畜牧业生产构成严重威胁，全国各地仔猪红痢的发病率呈上升趋势，兼有很高的死亡率。本病的主要致病因子为菌体产生的α和β毒素，其中β2毒素是1997年才确认的一种新的坏死性、致死性毒素［6］。与β1毒素一样，β2毒素也是引起人和动物坏死性肠炎的重要致病因子之一。业已证实，β2毒素的基因序列与β1毒素、α毒素及其它已知的产气荚膜梭菌毒素的序列没有明显的同源性，但却有相似的生物学活性［9］。抗β2毒素的抗体能识别纯化的β2毒素，并能与β1毒素发生弱反应，相反，抗β1毒素的抗体只能与β1毒素反应，而不能与β2毒素反应，表明二者的免疫相关性差，其机理尚不清楚［9］。而α毒素是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶，具有磷脂酶C(PLC)和鞘磷脂酶两种酶活性，能同时水解组成细胞膜的主要成分—磷脂酰胆碱和鞘磷脂，破坏细胞膜的完整性，导致细胞裂解，从而具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性。结果表明，用制备好的融合蛋白免疫ICR小白鼠后，包涵体加氢氧化铝凝胶的保护效果对于1LD100和2LD100的攻毒均达到100%，表明C型产气荚膜梭菌保护性抗原基因重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)能够表达α-β2-β1融合蛋白，并且该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体，从而达到对C型产气荚膜梭菌攻毒保护的目的。全细胞培养物加氢氧化铝凝胶抵抗的保护效果对于1LD100达到50%，2LD100达到20%。全细胞培养物的保护率未达到预期效果，分析原因可能是由于外源基因较大，在不加诱导剂的情况下不能很好的得到表达，且不能很好地释放至菌体外，从而降低了重组菌株的保护率。