产甲烷菌的生理生化特性

2014年秋季学期研究生课程考核（读书报告、研究报告）考核科目:微生物生理学学生所在院（系）:市政环境工程学生所在学科:环境工程学生姓名:丁达学号:14S127062学生类别:工程硕士考核结果阅卷人产甲烷菌的生理生化特性产甲烷菌是一类能够将无机或有机化合物厌氧发酵转化成甲烷和二氧化碳的古细菌，它们生活在各种自然环境下，甚至在一些极端环境中。产甲烷菌是厌氧发酵过程的最后一个成员，甲烷的生物合成是自然界碳素循环的关键链条。由于产甲烷菌在有机废弃物处理、沼气发酵、动物瘤胃中有机物分解利用等过程中的重要作用，同时甲烷是导致全球变暖的第二大温室气体,因此产甲烷菌和甲烷产生机理的研究备受关注。特别是近几年对产甲烷菌基因组的研究，使人们从基因组的角度、进化的角度对甲烷生物合成机理、甲烷菌的生活习性、形态结构等方面获得更深刻的理解。关键词：产甲烷菌；显著影响因子；生化特性一、引言目前能源与环境已成为影响人类社会可持续发展的重大问题，厌氧消化技术在能源生产和环境保护等方面具有突出的优势而倍受青睐。沼气发酵是自然界极为普遍而典型的厌氧消化反应，各种各样的有机物通过沼气发酵，不断地被分解代谢产生沼气，从而构成了自然界物质和能量循环的重要环节。厌氧消化是极为复杂的生物过程，在参与反应的众多微生物中，产甲烷菌的优劣和密度是影响厌氧消化效率和甲烷产量的重要因素，因此对产甲烷菌特征以及影响因子的研究成为重点。二、产甲烷菌概述产甲烷菌的研究开始于1899年，当时俄国的微生物学家奥姆良斯基（Omelianski）将厌氧分解纤维素的微生物分为两类，一类是产氢的细菌，后来称产氢、产乙酸菌；另一类是产甲烷菌，后来称奥氏甲烷杆菌（Methanobacillusomelauskii)。1901年Sohzgen对产甲烷菌的特征及对物质的转化进一步作了详细的研究。1936年Barker对奥氏甲烷菌又作了分离研究。但这些研究，由于厌氧分离甲烷菌的技术尚不完备，均未取得大的进展。直到1950年Hungate第一次创造了无氧分离技术才使甲烷菌的研究得到了迅速的发展。产甲烷菌是一类能够将无机或有机化合物厌氧消化转化成甲烷和二氧化碳的古细菌，它是严格厌氧菌，属于水生古细菌门（Euryarchaeota）。它们生活在各种自然环境下，如反刍动物的瘤胃、人类的消化系统、稻田、湖泊或海底沉积物、热油层和盐池，以及污泥消化和沼气反应器等人为环境中。产甲烷菌是厌氧消化过程的最后一个成员，甲烷的生物合成是自然界碳素循环的关键链条。由于产甲烷菌是严格的厌氧菌，对其研究需要较高的技术手段，所以，在20世纪70年代中期以前，产甲烷菌新种发现的不多，据《伯杰细菌鉴定手册》第八版记载，产甲烷菌只有一个科，即甲烷杆菌科，分三个属，有9个种。但是，随着其研究手段的飞速发展，和人们对产甲烷菌的关注，越来越多的产甲烷菌被人们发现，到目前为止，从系统发育来看，甲烷菌分成5个目，分别为甲烷杆菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）和甲烷超高温菌目（Methanop-yrales）。Schnellen第一个从消化污泥中分离纯化得到甲酸甲烷杆菌（Methanobacteriumformicium）和巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcinabarkeri），到目前为止，分离鉴定的产甲烷菌已有200多种。三、产甲烷菌显著影响因子产甲烷菌的活性受温度、pH值、有毒物质等环境因素以及C、N、P的比值以及无机元素等的影响，各因子所处条件对于产甲烷过程具有一定影响，根据前期研究结果，本文主要涉及微量元素等几种对产甲烷阶段具有重要影响的显著影响因子。1.微量元素对产甲烷菌的影响厌氧消化的产甲烷阶段对无机营养的缺乏十分敏感。许多废水厌氧生物处理中，均出现了出水中挥发性脂肪酸（VFA）偏高，气体产率下降的现象。起初人们认为是毒性物质抑制作用或是缺乏N、P营养。但后来许多实验证明，极易生物降解的VFA，在厌氧出水中之所以浓度偏高，不是毒性物质的抑制作用，也不是缺乏N、P营养，而是缺乏微量营养元素。Takashima和Speece发现微量金属元素的氯化物与无机营养液中其它物质混合后加入反应器内，当生物停留时间SRT为20d时，只能达到很低的乙酸利用率：4~8kg·m-3d-1；但如果微量金属元素的氯化物直接加入反应器内，则当生物停留时间SRT为5d时乙酸利用率即可高达30kg·m-3·d-1。因而，微量金属元素的加入方式也对产甲烷菌优势菌种变化产生很大影响。另外，李亚新等发现微量金属元素对毒性物质具有拮抗作用，从而缓解毒性物质对产甲烷菌的限制作用。因而微量金属元素的加入能使反应器内甲烷菌的优势菌种发生变化，使乙酸利用率提高数倍。但微量元素需直接加入反应器，从而保证甲烷菌的充分利用。微量金属营养元素能对毒性物质产生强烈的拮抗作用。在厌氧消化过程中补充微量金属元素是提高厌氧消化过程效率和稳定性的重要途径。2.硫酸盐对产甲烷菌的影响厌氧处理中，硫酸盐还原细菌以氢、乙酸、乳酸等为电子供体、以SO42-为末端电子受体，将其还原为S2-的厌氧反应称其为硫酸盐还原作用。由于硫酸盐还原细菌和产甲烷细菌都可利用这些基质，而且硫化物对产甲烷细菌具有毒害作用。普遍认为，硫酸盐还原作用影响产甲烷作用的进行。然而，各研究者的结论不尽相同，包括对于硫酸盐对产甲烷菌的致害浓度存在较大争议。Karhadkar等指出硫化物对产甲烷菌有抑制作用，但经过驯化，产甲烷菌可提高对硫化物的抵抗力。Parking等认为硫化氢对未经驯化的产甲烷菌的致害浓度为50mg·L-1。Isa等的研究表明硫化物对产甲烷菌的致害浓度从未经驯化时的20mg·L-1提高到驯化后的500mg·L-1。施华均等发现硫酸盐对于批量试验的影响并不大，对于连续运行试验的冲击则很大。因此，根据不同浓度的底物和不同的厌氧消化试验，要进行相关的硫酸盐抑制产甲烷菌的研究。3.pH值对产甲烷菌的影响厌氧微生物的生命活动、物质代谢与pH值有密切的关系，pH值的变化直接影响着消化过程和消化产物，不同的微生物要求不同的pH值。pH值的变化可引起微生物体表面的电荷变化，进而影响微生物对营养物的吸收，还可以影响培养基中有机化合物的离子化作用，从而对微生物有间接影响；另外酶只有在最适宜的pH值时才能发挥最大活性，不适宜的pH值使酶的活性降低，进而影响微生物细胞内的生物化学过程。再者过高或过低的pH值都降低微生物对高温的抵抗能力。4.氧化还原电位（Eh）对产甲烷菌的影响厌氧环境的主要标志是沼气发酵液具有低的Eh，其值应为负值。一般情况下，氧的溶入是引起厌氧消化中的Eh升高的最主要和最直接的原因。另外其它一些氧化剂或氧化态物质存在同样能使体系中的Eh升高，当其浓度达到一定程度时，会危害厌氧消化过程的进行。由此可见，体系中的Eh比溶解氧浓度能更全面地反映发酵液所处的厌氧状态。不同的厌氧消化体系和不同的厌氧微生物对Eh的要求不同。兼性厌氧微生物在+100mV以上时进行好氧呼吸，Eh为+100mV以下时进行无氧呼吸；产酸菌对Eh的要求不甚严格，可以在-100至+100mV的兼性条件下生长繁殖；中温及浮动温度厌氧消化系统要求的Eh应低于-300至-380mV；高温厌氧消化系统要求适宜的Eh为-500至-600mV。产甲烷菌最适宜的Eh为-350mV或更低。四、产甲烷菌的生化反应机理1.产甲烷菌的生化模型研究已建立了产甲烷微生物利用H2/CO2、甲醇和醋酸为基质产甲烷的生化代谢模型(图1)。图1表明：甲胺基类化合物(甲胺、二甲胺、三甲胺)在产甲烷代谢中经历与甲醇类似的代谢途径；甲酸通常先被氧化成二氧化碳，再进入产甲烷代谢。2.产甲烷菌的酶2.1氢化酶利用H2/CO2为基质的产甲烷菌通常包含两种氢化酶：一种是利用辅酶F420为电子受体的氢化酶，另一种是非还原性辅酶F420氢化酶。目前尚不清楚后一种氢化酶的生理电子受体，在以前的文献中常称它为还原甲基紫精氢化酶。实际上这是一种误导，因为上述两类氢化酶都能催化人工电子受体甲基紫精染料的还原。图1所示的产甲烷代谢中，前一种氢化酶催化次甲基四氢甲基喋呤还原成亚甲基四氢甲基喋呤，再进一步催化还原成甲基喋呤；后一种氢化酶的生理功能有两种：(1)激活二氧化碳，并将它催化还原成甲酰基甲基呋喃；(2)在甲基辅酶M的还原过程中提供电子。迄今为止，研究人员已对20多种微生物的氢化酶进行了较为详尽的研究。从已报道的研究结果来看，产甲烷菌的氢化酶结构类似于铁氧还蛋白，并含有对酸不稳定硫，其活性中心为[4Fe-4S]。2.2辅酶F420产甲烷细菌在420nm紫外光激发下产生兰-绿色荧光，主要原因是细胞中含有辅酶F420和甲基喋呤类化合物。辅酶F420首先被Fzeng和Cheeseman等所发现，后来被证实在产甲烷细菌中普遍存在。大多数产甲烷菌中辅酶F420含量相当高，一般不低于150mg/(kg湿细胞)，但在巴氏甲烷八叠球菌和瘤胃甲烷短杆菌中辅酶F420的含量却很低(20mg/(kg湿细胞))。目前除产甲烷菌外，还没有发现其它专性厌氧菌存在有辅酶F420和其它在420nm激发、480nm发射荧光的物质。因此，利用荧光显微镜检测菌落产生的荧光已成为鉴定产甲烷菌的一种重要技术手段。2.3辅酶MMcBride和Wolfe在甲烷杆菌M.O.H菌株中发现了一种参与甲基转移反应的辅酶，并将其命名为辅酶M。Gunsalus和Wolfe发现嗜热自养甲烷杆菌的细胞粗提取液中加入甲基辅酶M后，产甲烷速率提高30倍，这种现象被称为RPG效应。它表明辅酶M在产甲烷过程中起着极为重要的作用。辅酶M是迄今已知的所有辅酶中分子量最小的，也是产甲烷菌特有的一种辅酶。不同种的产甲烷菌或同种但利用的底物不同，所含辅酶M的数量也有差异，一般含量为0.3~1.6μmol/mg干重。2.4甲基呋喃如图1所示，在利用H2/CO2产甲烷的代谢途径中，甲基呋喃(MFR)是CO2激活和还原过程中的第一个载体，所以早期的文献中称它为二氧化碳还原因子(CDR)。甲基呋喃是一类C4位取代的氨基呋喃类化合物，存在于所有的产甲烷菌中。在产甲烷菌中目前至少发现了有五种R取代基不同的甲基呋喃衍生物。2.5四氢甲基喋呤四氢甲基喋呤(H4MTP)是产甲烷代谢C1化合物还原和甲基转移的重要载体。它从甲酰基甲基呋喃获得甲酰基，将其还原为甲基，最后将甲基传递给辅酶M。四氢甲基喋呤的化学结构与四氢叶酸有相似之处。甲烷八叠球菌spp菌株含有四氢甲基喋呤的另一种异构体——四氢八叠喋呤，只是R取代基中多了一个谷酰胺基。五、结论产甲烷菌实现了COD到清洁能源CH4的转化，对其生理生化特性的研究为开发更节约能源、更符合可持续发展要求的废水脱氮技术提供了生物学和微生物学基础。甲烷菌与厌氧氨氧化菌、好氧氨氧化菌的协同耦合作用又为新型的脱氮工艺提供了可能性。利用好3种菌群的协同作用,对于研究和开发投资省、运行稳定并适合于可持续发展的现代废水处理新技术具有重要意义。参考文献[1]胡纪萃，周孟津，左剑恶等.废水厌氧生物处理理论与技术[M].北京:中国建筑工业出版社，2003.[2]单丽伟，冯贵颖，范三红.产甲烷菌研究进展[J].微生物学杂志，2003，23(6):42-46.[3]SpeeceRE.AnacrobicDigestionofBiomass[M].USA:Else-vierAppliedSciencePub,1987.[4]张希衡.废水厌氧生物处理工程[C].北京:中国环境科学出版社，1996.[5]尹小波，连莉文，徐洁泉等.产甲烷过程的独特酶类及生化监测方法[J].中国沼气,1998,16(3):8-14.[6]YUY.ToxicityAssessmentofSomeNitroCompoundstoAcetateEnrichedMethanogens[D].MSThesisVanderbiltUniversity,1991.[7]Cla