人全血基因组快速提取方案

人全血基因组快速提取方案适用于遗传易感性筛查产品（CR）或其它产品。适用于EDTA抗凝处理后的血液样本（肝素抗凝样本不适用）。操作步骤：1吸取3mL（3倍体积）1X红细胞裂解液到一个15mL离心管中。注意：使用前应用去离子水将10X红细胞裂解液稀释至1X。2将EDTA抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取1mL加到上步装有1X红细胞裂解液的离心管中，颠倒6-8次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。注意1：应将血液加到装有红细胞裂解液的管中，而不能反加。注意2：无论处理多少样品，血液加入到红细胞裂解液中应迅速颠倒混匀，否则有可能降低得率。3室温放置10min，期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞。42000g，10min离心，倒掉红色上清，并小心的尽可能多的吸尽上清（不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约50µL上清。注意：离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的大部分都是红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入适量红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3和4（一般都需要再洗一次，或离心后将上清尽量吸取干净，用一定量PBS重悬细胞）。5漩涡震荡15s，重悬、充分分散白细胞团。注意：白细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要，白细胞未打散就加入裂解液，会导致白细胞不能充分裂解，形成肉眼可见的团块。6加入1mL细胞核裂解液到重悬的白细胞，迅速有力吹打混匀以理解白细胞。由于基因组DNA立即释放出来，混合物会马上变得十分粘稠，立刻停止吹打以免切断基因组DNA，颠倒旋转离心管10次保证裂解液和所有的白细胞接触并裂解。注意：这一步对是否获得满意的裂解效果和基因组完整性很关键。吹打力量太小，不足以迅速将细胞团打散并和裂解液混匀，形成肉眼可见团块而无法裂解完全（裂解液如果是和细胞团块而不是和分散的细胞接触，立刻会和细胞团块表面作用后形成粘稠的屏障而不容易再渗透入团块内部）。裂解液和细胞接触后基因组DNA会立刻释放出来，这时吹打力量过大又易造成基因组断裂。正确的做法就是迅速有力的吹打几次，几秒钟后基因组释放出来（变粘稠）立刻停止吹打，或改用大口径枪头（剪去枪头尖）轻柔吹打或者颠倒混匀。如果还有肉眼可见团块，可在65℃温育30-60min（不要超过1h）至裂解完全。7往上述溶液中加入20µL20mg/mL蛋白酶K溶液，56℃孵育30min左右。8（可选）在裂解物中加入RNaseA（20mg/mL）至终浓度30µg/mL，颠倒25次混匀，37℃温育15min去除残留RNA，然后冷却回室温。9加入330µL蛋白沉淀液后，在漩涡振荡器上高速连续震荡混匀25s，混匀后可能见到一些小的蛋白团块。注意：由于样品体积重量小，用漩涡振荡器震荡混匀产生的剪切力并不会剪切打断基因组DNA。如果用手震荡混匀，则不可以用手上下剧烈震荡混匀，只能适当力度震荡混匀，否则会剪断基因组DNA；但是力度也不能小，要保证充分混匀，将粘稠的裂解物打散开，否则DNA无法和蛋白质沉淀分离开，离心时会和蛋白质一起沉淀下来，造成DNA丢失或者降低产量。此外，混匀不充分也可能造成蛋白沉淀不充分，最后的产物污染有较多量的蛋白质。因此建议用漩涡振荡器混匀。1012500g，10min离心。此时应该可以在管底见到少量暗褐色的蛋白沉淀，也可能见到一些蛋白沉淀漂浮在液体表面。11小心吸取上清（大约1.3mL）到两个新的1.5mL离心管中（各650µL）。注意：吸取上清时，注意不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀。如果不小心将蛋白沉淀转入到新的离心管中，可再次离心2min后吸取上清。12每管中加入等体积的室温异丙醇（650µL），轻柔颠倒30次混匀或者直到出现棉絮状（丝状）白色DNA沉淀。13-20℃放置至少30min。1413000rpm，10min离心，弃上清。15加入1mL70%乙醇，颠倒几次漂洗DNA沉淀，13000rpm，10min离心，吸弃上清。在空气中晾数分钟使残留乙醇蒸发干净。注意：残留乙醇会影响下游酶促反应，应尽量除尽乙醇；但也不要过分干燥，否则DNA极难溶解。16每管中加入一定量ddH2O溶解DNA沉淀，轻弹管壁混匀。可以放在65℃温育30-60min（不要超过1个小时）。也可以在室温或4℃放置过夜来重新溶解DNA，中间不时轻弹管壁帮助溶解DNA。17溶解DNA可以存放在-20℃。1810X红细胞裂解液配制规模：2000ml（可按比例缩小）试剂名称终浓度用量0.5MEDTA10mM40mlNaHCO310mM1.68gNH4Cl1.44M154.08g注：固体试剂分别溶解后再加入EDTA，然后再定容。19核裂解液配制规模：2000ml（可按比例缩小）试剂名称终浓度用量1MTris-HCl(pH8.0)10mM20ml0.5MEDTA2mM8ml5MNaCl100mM40ml10%SDS1%200ml#注意：SDS最后加避免出现大量泡沫，定容时注意泡沫，等泡沫消了后再定容。20蛋白沉淀液（饱和生理盐水）5MNaCl直到氯化钠全部溶解并有氯化钠析出为止。在配制时可以适当加温。5MNaCl500ml1000ml加NaCl146.1g292.2g注：氯化钠要用医用级的不要用分析纯的。