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当前位置:首页 > 医学/心理学 > 药学 > 仪器分析第4讲高效液相色谱法.
第三章高效液相色谱分析HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)希腊语chroma(色彩)graphos(图谱)俄语Хроматография德语Chromatographie英语Chromatography液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术3-1高效液相色谱法的特点1.高效液相色谱法概述1960年代,由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性,为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质,气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪,开启了高效液相色谱的时代。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书,标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。它是在经典液相色谱基础上,引入了气相色谱的理论,在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点.为了更好地了解高效液相色谱法优越性,现从两方面进行比较:一、概述1.高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化.液体的流动相高速通过时,受到的阻力较大,为了能迅速通过色谱柱,必须对流动相施加高压15~35Mpa,因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较经典液相色谱法高效液相色谱法粒径(μm)75-6003-50(常用5-10)柱前压力(atm)0.01-1.020-300分析时间(h)1-200.05-1.0色谱柱长度(cm)50-2002-30柱效(块/m)2-50104-105样品用量(g)1-1010-6-10-22.高效液相色谱法与气相色谱法(l)气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物,它们仅占有机物总数的20%.对于占有机物总数近80%的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质,目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析.(2)高效GC1000塔板/m(填充柱)HPLC3W塔板/m(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的,而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作.总之,高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点,并用现代化手段加以改进,因此得到迅猛的发展.高效液相色谱与气相色谱的比较GCHPLC应用范围热稳定、低沸点的物质热不稳定、高沸点、离子型的物质热力学理论较成熟正在发展中分析成本低高分离能力与柱的类型有关较高液相色谱仪器highperformanceliquidchromatograph3.高效液相色谱法的应用1.药物分析约80%的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手性药物的分离分析。2.食品分析①食品本身组成,特别是营养成分,如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析;②食品添加剂,如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析;③食品污染物,如农药残余和黄曲霉素等的分析。3.制备分离应用要制备或提取一些高纯化合物,如新合成化合物的结构鉴定,药物的生物和毒理试验。4.高效液相色谱法的特点高压(150×105~350×105Pa)高速(in1hr)高效(3w/m)高灵敏度(UV-ng;FL-10pg;μTAS)人参、西洋参与三七的鉴别min1020304050mAU050100150200DAD1C,Sig=203,16Ref=360,100(H:\1\DATA\HUPING\GSSIDE14.D)min1020304050mAU05101520253035DAD1C,Sig=203,16Ref=360,100(H:\1\DATA\HUPING\GSSIDE15.D)min1020304050mAU020406080100DAD1C,Sig=203,16Ref=360,100(H:\1\DATA\HUPING\GSSIDE16.D)R1Rg1ReRb1RdABCRg1Rg1ReReRfRb1RcRb2RdRc三种药材的HPLC指纹图谱3-2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素H=A+B/μ+Cμ1.高效液相色谱中的速率方程高效液相色谱中的速率方程涡流扩散项纵向扩散流动相传质滞留区传质固定相内传质uDdCDdCDdCuDCdHsfsmpsmpmmdp)(22222.对速率方程的讨论选用细颗粒填料可获高柱效(5μm)流动相流速低,有利于达到高柱效选用黏度小的流动相有利于提高柱效温度的影响(适当提高柱温以降低流动相黏度)液膜厚度的影响3.柱外效应由于色谱柱之外的因素引起的色谱峰的展宽,例如进样系统、连接管路及检测器的死体积等。3-3高效液相色谱的类型及其分离原理液—液分配色谱及化学键合相色谱液—固吸附色谱离子交换色谱离子色谱空间排阻色谱流动相和固定相都是液体分离原理:利用组分在两相中溶解度的差异固定相:载体+固定液早期物理或机械法涂渍固定液,由于易流失已较少采用;现在应用最广的是化学键合固定相:将各种不同基团通过化学反应键合到担体(硅胶)表面的游离羟基上。liquid-liquidpartitionchromatography1、液-液分配色谱液—液分配色谱固定液类型:β,β’—氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等。液—液色谱流动相应尽可能不与固定液互溶,两者的极性差别应很大。固定液为极性、流动相为非极性的液—液色谱称为正相色谱,反之,则称为反相色谱。正相色谱——固定液极性流动相极性(NLLC)极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱——固定液极性流动相极性(RLLC)极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱适于分离非极性组分液液分配色谱法液—液分配色谱应用:液—液色谱能分离多种类型化合物,如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面1.分离原理:分配+吸附(以LLC为基础)2.特点:不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱化学键合固定相(chemicallybondedphasechromatography)分离原理:利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异分离前提:K不等或k不等流动相为液体,固定相为固体吸附剂2、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatography液—固吸附色谱固体吸附剂主要类型:极性的硅胶(应用最广)氧化铝分子筛非极性的活性炭液—固吸附色谱应用:分离极性不同的试样分离含极性基团相同但数目不同的试样分离异构体3、离子交换色谱ion-exchangechromatography固定相:阴离子或阳离子交换树脂;流动相:阴离子交换树脂作固定相,采用酸性水溶液;阳离子离子交换树脂作固定相,采用碱性水溶液;基本原理:组分在固定相上发生的反复离子交换反应;组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大,保留时间长;阳离子交换:R—SO3H+M+=R—SO3M+H+阴离子交换:R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-应用:离子及可离解的化合物,包括氨基酸、核酸等。离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如,对于那些不能采用紫外检测器的被测离子,如采用电导检测器,由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。为了解决这一问题,1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。4、离子色谱ionchromatography离子色谱应用:待测阴离子随流动相通过离子交换树脂时发生离子交换反应。至今离子色谱是分离分析常见无机混合阴离子的最佳分析方法。5、空间排阻色谱(凝胶色谱)size-exclusionchromatography固定相:凝胶gel具有一定大小孔隙分布。原理:按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙,由其中通过,出峰最慢;中等分子只能通过部分凝胶空隙,中速通过;而大分子被排斥在外,出峰最快;溶剂分子非常小,故在最后出峰。整个试样都在tM(死时间)之前出峰。空间排阻色谱法特点:峰扩展比较小流动相和固定相的选择比较简单不能分离异构体(10%)可对相对分子质量在100-8*105范围内的化合物按质量分离液相色谱分离类型的选择(1)根据相对分子质量选择相对分子质量十分低的样品,其挥发性好,适用于气相色谱.标准液相色谱类型(液--固、液--液、及离子交换色谱)最适合的相对分子质量范围是200~2000.对于相对分子质量大于2000的样品,则用尺寸排阻法为最佳.(2)根据溶解度选择如:样品可溶于水并属于能离解物质,以采用离子交换色谱为佳;如:样品可溶于烃类(如苯或异辛烷),则可采用液--固吸附色谱(3)根据分子结构选择例如,酸、碱化合物宜用离子交换色谱;脂肪族或芳香族宜用液--液分配色谱或液--固吸附色谱;异构体用液--固吸附色谱;同系物用液--液分配色谱.等等。分离类型选择总结,P933-4液相色谱法固定相高效液相色谱柱是HPLC的心脏。左右心房分别是:固定相和其填装技术(-)固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类,可分为刚性固体和硬胶两大类.刚性固体以二氧化硅为基质,可承受7.O×108~1.O×109Pa的高压,可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒.(2)全多孔型由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体;早期采用100μm的大颗粒,表面涂渍固定液,性能不佳已不多见;现采用5~10μm的小颗粒,比表面积和柱容量都很大。(1)表面多孔型基体是30~40μm实心玻璃微球,表面附着一层厚度为1~2μm的多孔活性材料,如硅胶、氧化铝等。表面积小,柱容量低。固定相按照空隙深度分类:1、液液色谱法、键合相色谱法及离子对色谱法固定相1)全多孔型单体(porousmicrobeadssupport)2)表层多孔型担体(pellicularmicrobeadssupport)化学键合固定相(1960后)在硅胶表面利用硅烷化反应制得Si-O-Si-C型的反应该化学键稳定,是广泛使用的固定相(C-18)。类型分离方式应用特点C-18反相、离子对普适性好,保留值大。溶于水的高极性化合物、中等极性化合物C-8反相、离子对与C-18类似,保留值略小C-3,C-4反相保留值小,适合肽类和蛋白质苯基反相保留适中,选择性不同。非极性、中等极性化合物-CN反相、正相选择性与硅胶类似,保留小,用途广-NH2反相、正相分离糖类、核苷酸、固醇等二醇基正相分离有机酸、排阻分蛋白质等醚基反相、正相分离酚类、芳硝基化合物,保留比C-18强聚苯乙烯基反相pH使用范围广,对部分分离峰形好,寿命长常用固定相表3-2化学键合固定相特点表面没有液坑,传质快无固定液流失可以改变选择性(通过键合不同官能团)有利于梯度洗提,及配用灵敏的检测器2.液固吸附色谱法固定相(2)高分子多孔小球:YSG原理:吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点:柱选择性好,峰形好,柱效低适用:分离弱极性化合物(1)硅胶表孔硅胶(薄壳硅胶)全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108堆积硅珠YQG3~4μm8×108理想原理:吸附特点:峰易拖尾适用:分离极性化合物在气相色谱中,载气是惰性的,常用的只有三四种,他们的性质差异也不大,所以要提高柱子的选择性,只要选择合适的固定相即可。但在液相色谱中,当固定相选定后,流动相的种类、配比能显著的影响分离效果,因此,流动相的选择也非常重要。液相色谱的流动相又称为:淋洗液,洗脱剂。3-5液相色谱法流动相流动相的选择原则流动相纯度要高(色谱纯)且价格便宜应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样要有适宜的溶解度溶剂的粘度要小些为好应与检测器相匹配常用溶剂的极性顺序:水(最大)甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯
本文标题:仪器分析第4讲高效液相色谱法.
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