乳酸测定-纸层析原理

乳酸等有机酸的测定——纸层析法一、展层试剂展层剂：水：苯甲醇：正丁醇=1:5:5(V/V，另加1%的甲酸)；显色剂：0.04%溴酚蓝乙醇溶液（用0.1%/LNaOH调节pH至6.7）；2%乳酸（标准液），无水乙醇二、纸层析1、制备待测样品——从酸奶中分离的纯种接种到含糖发酵液体培养基的试管中，37℃培养3天，（离心，收集上清液）；2、层析滤纸的制备——将新华1号层析滤纸剪成25cm*10cm的长条状，在距层析纸一端约3cm处用铅笔划线，在其上再画4点做点样标记（据两侧1.7cm处各点一点，中间2点间距为2.2cm）并注明点样编号（样品液2点，2%乳酸和未接种的糖发酵液培养基各一点）。3、配制展开剂4、点样：先用无水乙醇清洗微量进样器，再分别取各样品20ul点样，每一个样品均需要用电吹风吹干。（分别吸取发酵液，多次点样于滤纸条上，样点直径不宜超过2mm，）5、层析：将点好样的层析纸放入层析缸中，经展层剂蒸汽饱和一夜后，再正式让底部均匀浸入展开剂中展层，但不可浸及样点。观察展开情况，待展开剂前沿到达离层析纸另一端约5cm处（上行20cm，在室温20度下8~9h）左右后，取出层析纸，空气中风干，吹干。6、显色——以0.04%溴酚蓝乙醇溶液为显色剂，待层析液挥发之后，向层析滤纸均匀喷洒（用喷雾器），对比标准乳酸与试样中所含乳酸所出现黄色斑点位置，并参考对照样品的层析斑，以确定试样中是否含有乳酸，并计算Rf值。注释：物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值Rfvalue又称Rf值)来表示：Rf=原点到层析中心的距离/原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关，是一个定性分析的重要参数。纸层析法是用纸作为载体的一种色谱法，PaperChromatography原理纸层析法又称纸色谱法，依据极性相似相溶原理，是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质分配系数不同，因而扩散速度不同，从而达到分离的目的。（也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。）将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。试样经层析后可用比移值（Rf）表示各组成成分的位置（比移值=原点中心至色谱斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离之比），由于影响比移值的因素较多，因此一般采用在相同实验条件下对照物质对比以确定其异同。作为单体鉴别时，试样所显主色谱斑点的颜色（或荧光）与供置，应与对照（标准）样所显主色的谱斑点或供试品-对照品（1∶1）混合所显的主色谱斑点相同。作为质量指标（纯度）检查时，可取一定量的试样，经展开后，按各单体的规定，检视其所显杂质色谱斑点的个数或呈色（或荧光）的强度。作为含量测定时，可将色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定，也可用色谱扫描仪测定。用途通常可用于叶绿素的色素成分检验，氨基酸的鉴定及测定，橘皮精油成分检验及一些特定细胞筛查等实验。