仪器分析实验设计方案2

熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定【摘要】以α-萘胺为显色剂，利用紫外可见分光光度计，探究实验的最佳条件（最大波长的测定，显色剂用量的选择以及显色时间的选取），绘制亚硝酸盐的标准曲线，测定熏肉制品中亚硝酸盐的含量。【关键词】肉制品，亚硝酸盐，紫外-可见分光光度法【引言】（一）熏肉制品与亚硝酸盐简介肉制品是一类深受人民群众喜爱的食品，在其生产过程中多采用亚硝酸盐作为发色剂，它不仅能使肉制品保持良好的色泽，还能抑制肉毒梭状芽孢杆菌，保证肉制品的后熟风味。但近年来由于亚硝酸盐摄入量过多引起的食物时中毒时有发生，且加硝处理过的肉制品中的亚硝酸盐可与胺类生成强致癌物亚硝胺，对人体健康产生潜在的危害。1亚硝酸盐的性质亚硝酸和硝酸的钠盐和钾盐常被加入用于腌肉的混合物中，用来产生和保持色泽、抑制微生物和产生特殊的风味。此外，亚硝酸盐（150-200mg/kg）可抑制罐装碎肉和腌肉中的梭状芽孢杆菌。亚硝酸盐的抗微生物作用为它使用于可能生成长肉毒梭状芽孢杆菌的腌肉中提供了正当的理由。亚硝酸盐含量只要控制在安全范围内使用不会对人体造成危害。肉制品中，亚硝酸盐含量不得超过30mg/kg，这是因为亚硝酸盐的中毒剂量是200毫克以上，而正常膳食中的亚硝酸盐即使是大量用亚硝酸盐做食品添加剂的肉类，也不会超过50毫克。2发色原理亚硝酸盐在肉中形成一氧化一氮，而一氧化一氮与血红素类化合物作用生成亚硝酰肌红蛋白，这种色素产生了腌肉的红色。3中毒后症状亚硝酸盐是不会蓄积在体内的，膳食中绝大部分亚硝酸盐随尿排出，不会对人体造成危害。过量亚硝酸盐进入人体，会氧化血液中的血红蛋白为高铁血红蛋白，后者无携氧功能，导致组织缺氧，引起肠原性青紫症，皮肤青紫是本病的特征，尤以口唇青紫最为普遍。口服亚硝酸盐10分钟至3小时后，可出现头晕、恶心、呕吐等症状。严重者出现意识丧失、昏迷、呼吸衰竭，甚至死亡。4亚硝酸盐中毒作用机理当血红蛋白中的铁处于+2（亚铁）并且缺乏配体键合所需的第6部位时它被称为肌红蛋白，是由珠蛋白和血红素组成的络合物，位居血红蛋白中央的铁原子(d2sp3)具有6个配位部位，其中4个分别被4吡咯环上的氮原子占据，第5个配位部位与珠蛋白的组氨酸残基键合，剩余的第6个配位部位可与各种配基提供的电负性原子络合。亚硝酸盐为强氧化剂，进人人体后，可使血中低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去运氧的功能，导致组织缺氧。（二）亚硝酸盐的测定方法为了有效的控制其毒性，检测其在食品中的残留量，目前常采用的测定方法主要有光度法、色谱法、电化学法。其中光度法又分为盐酸萘乙二胺法、格里试剂比色法、催化光度法、紫外光度法；色谱法中有离子色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法；电化学法又分为示波极谱法、伏安法。还有一些新的方法如化学发光法、荧光法、原子吸收光谱法等。1光度法1.1盐酸萘乙二胺法在弱酸性溶液中，NO2-与对氨基苯磺酸反应生成重氮化合物后，再与盐酸萘乙二胺偶联生成紫红色的偶氮染料，用分光光度法在540nm处测定，与标准曲线比较定量。1.2格里试剂比色法GB5009．033—2003测定方法中，其中一种方法就是格里试剂比色法，其原理是在弱碱性条件下，用热水从样品中提取NO2-，然后用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白，过滤后，在弱酸条件下，NO2-与对氨基苯磺酸发生重氮化后，再和N—1—萘基乙二胺耦合形成红色偶氮染料，最大吸收波长为538nm，所选择的显色剂不一样，最大吸收波长也有所不同。针对卫生标准的规定和工艺的不同，以及检测过程中pH、温度、放置时间对显色的影响，在检测肉制品中NO2-时，格里试剂比色法的准确性和稳定性均高于盐酸萘乙二胺法。另外用对氨基苯磺酰胺代替对氨基苯磺酸，其灵敏度、精密度均得到提高。1.3催化分光光度法主要原理是在一定的温度和酸性条件下，NO2-对KBO3氧化染料(或指示剂)而褪色的反应具有较明显的催化作用，且在一定NO2-的浓度范围内，吸光度变化与NO2-浓度成较好的线性关系，因此，可用该原理定量溶液中NO2-的浓度。1.4紫外分光光度法在稀盐酸介质中，NO2-与碱性品红发生重氮反应，用8—羟基喹啉作偶联剂，在弱碱性条件下，生成茶红色偶氮染料来定量测定NO2-含量。光度法是测定NO2-的经典方法，其检测所需费用较低，灵敏度较高，不经分离可直接同时测定样品中NO3-和NO2-，具有较好的选择性，操作简便。”2色谱法2.1离子色谱法主要原理是当淋洗液携带样品进入分离柱后，样品离子便与离子交换功能基的平衡离子争夺树脂的离子交换位置。经过多次竞争达到交换平衡。由于不同离子对树脂固定相的亲和力不同，通过淋洗液的不断淋洗，各种离子便先后从色谱柱上被洗脱下来，实现了分离。通过检测器，即可经检测器检测各种离子，得到一个个色谱峰，然后与标准进行比较，根据保留时间定性，根据峰面积或峰高定量。用紫外检测离子色谱法对酱腌菜中的NO3-与NO2-进行定量分析。样品经过超声提取后，以1.8mmol/LNaCO3及1.7mmol/LNaHCO3为淋洗液，经DIONEXIonpacAS4A—SC分析柱分离，于210nm处紫外检测。该法可以采用其他类型的色谱柱进行分离，所用的检测器也可选用化学抑制型电导检测器(可大幅度降低淋洗液的电导值)。离子色谱法所用的化学试剂较少，并且实验耗时相对来说较少。2.2高效液相色谱法食品中NO2-含量的重氮化耦合高效液相色谱法测定方法是将食品样品中蛋白质、脂肪除去后，NO2-与对氨基苯磺酸重氮化，再与N一1一萘乙二胺耦合之后，进行HPLC分析。若采用反相高效液相色谱法一二极管阵列检测器法测定卤肉制品中NO3-及NO2-的含量，则该方法选择四丁基溴化铵作为离子对试剂，与NO3-和NO2-阴离子形成中性缔合物，在甲醇一混合磷酸盐流动相中，被非极性键合相柱(ODS)分离并定量检测。该方法灵敏度高，并且样品中其他成分如色素、动物性蛋白等对检测不构成干扰。3电化学法3.1示波极谱法GB5009．033—2003测定方法中，另外一种方法是示波极谱法，试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下，NO2-与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8—羟基喹啉耦合形成橙色染料，该染料在汞电极上还原产生电流，电流与NO2-的浓度呈线性关系，可与标准曲线比较定量。3.2伏安法伏安法是在酸性介质中以玻碳电极(GCE)为工作电极的铁氰化钾电催化还原亚硝酸盐的电化学行为及电分析方法。当K3Fe(CN)6浓度一定时，电催化还原峰电流与NO2-浓度在4.0×10-7～1.0×10-4mol/L范围时有良好的线性关系，运用方波伏安法在优化条件下测定了水样中亚硝酸盐含量，测定结果令人满意。相比较可以发现，光度法所用仪器设备简单、价廉、灵敏度较高，具有实用性和可操作性。由于NO2-在固体电极(如GCE，Au和Pt等)上氧化(或还原)一般需要较高的过电位，因而不易直接发生电化学氧化(或还原)反应，故电化学方法的使用范围不如光度法使用范围广。而荧光法、化学发光法、原子吸收光谱法等对仪器的要求较高。分光光度法以其设备简单、操作快捷、灵敏度高、结果直观的优点，深受欢迎。本实验研究了以α-萘胺为显色剂，利用紫外可见分光光度计测定肉制品中的亚硝酸盐的含量的方法。结果证明，此方法简单、快捷、准确，是一种食品检测的好方法。现实生活中，食品检测人员经常采用亚硝酸盐快速测试盒测定食品中亚硝酸盐的含量，亚硝酸盐快速测试盒采用N-1-萘乙二胺代替传统的a-萘胺，使显色的灵敏度高，显色的摩尔质量增大，测定出来的结果更准确，但鉴于各方面的局限性，本实验我们采用紫外分光光度法，以a-萘胺为显色剂测定熏肉制品中亚硝酸盐的含量。【实验目的】①了解熏肉中亚硝酸盐的作用和危害，以及含量测定的方法；②掌握紫外分光光度法测定亚硝酸盐含量的基本原理与操作方法；③明确亚硝酸盐的测定与控制成品质量的关系。【实验原理】本次试验选定紫外分光光度法来测定熏肉中亚硝酸盐的含量：以α-萘胺为显色剂，利用可见分光光度计测定肉制品中的亚硝酸盐的含量，其实验原理如下：样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，抽提分离出亚硝酸盐，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐，此重氮盐再与α-萘胺试剂发生偶合反应，生成紫红色偶氮化合物，其最大吸收波长为547nm，其颜色的深度与样液中亚硝酸含量成正比，可测定吸光度并与标准曲线比较定量。反应式如下：NH2SO3HN+NSO3HNO2-H+OH2+++NSO3HNNH2N+NSO3H+NH2肉制品中亚硝酸盐含量==50150040100010001mX（mg/kg）式中：X为由测得的吸光度在标准曲线上对应的亚硝酸钠质量浓度（μg/mL）；m为样品质量（g）。经文献和实验经验参考，试剂空白和去离子水对吸光度的影响相差不大，因此对于实验的参比溶液的选择根据实验方便原则，选择去离子水为参比溶液。此外，分别在15%、20%与25%的盐酸中的测定结果显示，酸度变化对显色反应的影响并不是很明显，实验中用20%的盐酸溶解对氨基苯磺酸测得的吸光度相对较大，因此实验选取20%的盐酸溶解对氨基苯磺酸。【仪器与试剂】⒈试剂：（1）亚铁氰化钾溶液：称取10.619克亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于水，并稀释至100mL。（2）乙酸锌溶液：称取22.0克乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]，加3mL冰醋酸溶于水，并稀释至100mL。（3）饱和硼砂溶液：5.0克硼酸钠（Na2BO4·10H2O）溶于100mL热水中，冷却备用。（4）0.4%对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%盐酸中，臵棕色瓶中，混匀，避光保存。0.2%α-萘胺溶液(2g/L)：称取0.1g盐酸萘乙二胺，以水定容50.00mL，避光保存。（5）亚硝酸钠标准溶液（200.0μg/mL）：精确称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠（优级纯），加水定容到500.00mL。（6）亚硝酸钠标准溶液（5μg/mL）：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液2.50mL，臵于100mL的容量瓶中，加水稀释到刻度。⒉仪器：①砧板，菜刀②UV8500紫外-可见分光光度计③比色皿2个④分析天平⑤1mL、2mL、5mL、10mL、20mL移液管各1支⑥50mL烧杯1个，100mL烧杯1个，500mL烧杯1个⑦10mL量筒1个，100mL量筒1个⑧50mL容量瓶12个，100mL容量瓶4个，200mL容量瓶1个，500mL容量瓶2个⑨滤纸、漏斗、玻璃棒过滤装置一套【实验内容与步骤】1、样品处理样品中硝酸盐及亚硝酸盐的提取：称取经剁碎混合均匀的样品5.0565g于100mL烧杯中，加入硼砂饱和溶液12.5mL，以玻璃棒搅拌，然后用70℃左右的水约300mL，将其稀释转移到500mL容量瓶，沸水浴中加热15分钟，取出，边转动边加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加5mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质。冷却到室温，用水定容，摇匀。放置片刻，去除上层脂肪并过滤，弃去前30mL滤液。2、最大波长的测定于内层1cm比色皿中，用空白溶液即参比溶液进行基线调零。调零后，把靠近外面的比色皿拿出换装浓度为0.2040μg/mL的标准溶液在610nm—450nm之间进行扫描，得到最大吸收波长λmax=_545.7_nm。3、亚硝酸钠标准曲线的绘制用移液管精确吸取亚硝酸钠标准液(5μg/mL)0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5和2.0mL于一组50mL容量瓶中，各加水至约25mL，分别加2mL0.4g/mL对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3—5min后，各加入2mL0.2%α-萘胺溶液，并用水定容到50mL，摇匀。（浓度分别为0.00、0.0204、0.0408、0.0612、0.0816、0.1020、0.1530和0.2040ug/mL）静置15min后，用1cm比色皿，用分光光度计在最大波长下测定吸光度，以蒸馏水为空白。以测得的各比色液的吸光度对应的亚硝酸浓度作曲线。4、亚硝酸盐含量的测定取20mL待测液于25mL容量瓶中，加1mL0.4%