二种菊头蝠八种组织三种同工酶的研究

1二种菊头蝠八种组织三种同工酶的研究王艳梅，牛红星(河南师范大学生命科学学院,河南新乡,453007)摘要：采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直板活性电泳，分析了二种菊头蝠的心脏、肝脏、肾脏、胸肌、肺、胃、小肠、舌8种组织的酯酶（EST）、乳酸脱氢酶（LDH）、苹果酸脱氢酶（MDH）3种同工酶的活性和分布。结果表明：二种菊头蝠8种组织的3种同工酶存在差异，其分布具有明显的组织特异性，与器官或组织所执行的功能有关。关键词：角菊头蝠；马铁菊头蝠；同工酶；电泳；组织特异性中图分类号：Q814.9文献标识码：角菊头蝠(Rhinolophuscornutus)和马铁菊头蝠(R.ferrumequinum)同属菊头蝠科(Rhinolophidae)菊头蝠属(Rhinolophus),目前冯江等、吴毅等分别对这两个物种的回声定位、遗传学方面进行了研究[[1-5],但未见有关同工酶的报道.自从Markert于1950年代发现同工酶以来[6],同工酶的研究日益活跃,利用同工酶来探讨物种的遗传、进化和系统分类已受到人们的广泛重视[7]，国内外也对其他种类蝙蝠的同工酶进行了研究.本文采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直板电泳,对角菊头蝠和马铁菊头蝠8种组织的3种同工酶进行了比较研究,以期能为探讨翼手类的分类、起源和演化提供可靠的生理生化依据,现将结果报道如下.1材料和方法1.1材料本实验所用材料为角菊头蝠和马铁菊头蝠,♀、♂各3只，均为性成熟个体,于2005年1月采自河南省济源市.1.2样品制备用乙醚轻度麻醉动物后,即取心脏、肝脏、肾脏、胸肌、肺、胃、小肠、舌各0.1ｇ,用冷生理盐水洗去血污后,加1ml0.01mol/Ｌ磷酸缓冲液(pＨ7.2),用玻璃匀浆器在冰浴上匀浆,匀浆液经12000rpm离心15min,取上清液与40%甘油按比例4:1混合作电泳样品,4℃冰箱中暂存备用.1.3电泳及染色采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直板电泳.分离胶浓度为7.5%(pＨ8.9),浓缩胶浓度为3.0%(pＨ6.7),电极缓冲液为pＨ8.3Tris-甘氨酸溶液.染色按照Shaw的染色方法[8].1.4拍照及模式图的绘制染色后的凝胶立即拍照,然后用Photshop软件编辑.按同工酶相对迁移率=迁移距离/溴酚蓝迁移距离,计算同工酶的相对迁移率(Rf值),并绘制成模式图.相同方法重复电泳3次,结果基本一致.2结果2.1酯酶(EST)同工酶谱(图1)在两种菊头蝠的8种组织中,EST的酶带数、Rf值、带的强弱均有不同程度的差异.肾脏和肝脏酶谱稍相似,分别有3和4条相同酶带,酶活性相近;心脏、胃有1条相同酶带且酶活相近,其余组织则没有相同酶带.但两种菊头蝠的肾脏、肝脏和小肠均具有较多的酶带.酶带具体分布及相对迁移率(Rf值)见表1.——————————基金项目：河南省科技攻关项目（0224070051）河南省动物学省级重点学科经费资助作者简介：王艳梅（1977-），女，硕士学位，研究方向：动物学，Email：[e-mail]2F，肺脏；H，心脏；K，肾脏；L，肝脏；M，肌肉；S，胃；T，舌；X，小肠1，马铁菊头蝠；2，角菊头蝠表1各组织酯酶同工酶区带相对迁移率及谱带分布酶带肺心脏肝脏肾脏胸肌胃小肠舌f1f2h1h2l1l2k1k2m1m2s1s2x1x2t1t2Rf10.3280.328Rf20.3680.3680.3680.368Rf30.4040.4040.4040.4040.4040.4040.404Rf40.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.4220.422Rf50.4780.4780.4780.4780.4780.4780.478Rf60.5070.5070.5070.5070.5070.507Rf70.5140.5140.5140.5140.514Rf80.5810.5810.5810.5810.5810.5810.581Rf90.6040.6040.6042.2乳酸脱氢酶(LDH)同工酶谱(图2)在两种菊头蝠的8种组织中,仅马铁菊头蝠的心脏、肝脏、胸肌、小肠出现了LDH5酶带,其余组织及角菊头蝠的各组织均表现为LDH5酶带缺失.各组织中LDH同工酶向正极的泳动速度不一致,LDH4酶带差异较为显著,且在心脏、胸肌与舌3种组织中分别出现了LDH1和LDH4亚带.LDH同工酶在各组织中活性也不同,心脏、肌肉、小肠中酶活性最强,肺中酶活性最低.LDH同工酶酶带具体分布及相对迁移率(Rf值)见表2.F，肺脏；H，心脏；K，肾脏；L，肝脏；M，肌肉；S，胃；T，舌；X，小肠1，马铁菊头蝠；2，角菊头蝠Rf1Rf2Rf3Rf4Rf5Rf6Rf7Rf8Rf9+图1不同组织EST同工酶谱图2不同组织LDH同工酶谱—LDH5LDH4LDH3LDH2LDH1+F1F2H1H2L1L2K1K2M1M2S1S2X1X2T1T2+—F1F2H1H2L1L2K1K2M1M2S1S2X1X2T1T2+3表2各组织乳酸脱氢酶同工酶区带相对迁移率及谱带分布酶带肺心脏肝脏肾脏胸肌胃小肠舌f1f2h1h2l1l2k1k2m1m2s1s2x1x2t1t2LDH10.6830.6830.6830.683LDH20.5560.5560.5560.5560.5560.5560.5730.5560.5560.556LDH30.4680.4860.4860.4860.4920.4860.4860.4860.4680.4860.4860.4680.486LDH40.3140.3320.3460.3320.3460.3140.3320.3460.3320.3320.3140.3320.3320.3140.332LDH4-0.3070.3140.307LDH50.1830.2230.1920.1880.2230.1880.2230.2230.1920.1920.223LDH5-0.1920.1920.1832.3苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶谱(图3)8种组织的MDH同工酶,均有活性较强的m-MDH酶带,除心脏、肝脏、肌肉外,其余组织的酶谱完全相同,活性也基本相近;s-MDH酶带仅在马铁菊头蝠的心脏、肝脏、肌肉和角菊头蝠的心脏中出现.MDH同工酶酶带具体分布及相对迁移率(Rf值)见表3.F，肺脏；H，心脏；K，肾脏；L，肝脏；M，肌肉；S，胃；T，舌；X，小肠1，马铁菊头蝠；2，角菊头蝠表3各组织苹果酸脱氢酶同工酶区带相对迁移率及谱带分布酶带肺心脏肝脏肾脏胸肌胃小肠舌f1f2h1h2l1l2k1k2m1m2s1s2x1x2t1t2m-MDH-0.0880.0880.0880.088m-MDH0.1310.1310.1310.1310.1310.1310.1310.1310.1310.1310.1310.1310.1310.131s-MDH0.2090.2090.2090.2093.讨论EST是催化酯类化合物水解并进入中间代谢的重要酶类,其作用除维持细胞正常的能量代谢外,还能水解大量非生理正常存在的酯类化合物[9].这两种菊头蝠既有相同的酶带,如肝脏都具有Rf4、Rf6、Rf7、Rf8,肾脏都具有Rf4、Rf7、Rf8,又表现出明显的组织特异性和物种特异性(如马铁菊头蝠有Rf9，角菊头蝠有Rf1、Rf2).而且EST同工酶在肝脏、肾脏和小肠中表达的酶带数量较多,这与器官的功能是相关的,肝脏和肾脏是机体最重要的解毒器官,物质代谢活跃,小肠是脂类物质消化、吸收的主要部位.LDH同工酶是目前了解最清楚的一种糖代谢的关键酶,主要生理功能是催化乳酸和丙酮酸之间的氧化还原反应,在糖的有氧氧化和无氧酵解之间起着重要作用,也是糖异生的重要酶系之一.这两种菊头蝠酶谱有着较大的差异,仅小肠的酶谱及活性相似,但心脏、肌肉中LDH1均表现出高活性,与LDH催化乳酸脱氢转化为丙酮酸有关,这与翼手目动物适应飞行,消+m-MDHs-MDH图3不同组织MDH同工酶谱F1F2H1H2L1L2K1K2M1M2S1S2X1X2T1T2—++4耗能量大有着密切联系.这与善于飞行的鸟类相似(胸肌的LDH是耗氧型的),与冯文和等报道的大熊猫、犬、羊等哺乳动物的骨骼肌LDH同工酶(都是厌氧型的)相比,明显不同[10-12].动物有机体中m-MDH和s-MDH的催化功能是不相同的,m-MDH属三梭酸循环酶系,与葡萄糖异生过程相关,而s-MDH催化草酰乙酸和苹果酸一丙酮酸循环,与乙酰CoA的脂肪合成过程密切联系[13,14].m-MDH酶带在8种组织中均有发现,而s-MDH酶带仅在3种组织中发现,说明这两种蝙蝠主要是以线粒体型酶为主,而线粒体型酶属于三羧酸循环酶系,具体的功能是催化苹果酸脱氢,与葡萄糖的异生过程有关[15],这与蝙蝠的飞行是相适应的.本文通过对马铁菊头蝠和角菊头蝠的8种组织3种同工酶的对比研究，结果显示两种菊头蝠的LDH同工酶酶谱与同属内的中菊头蝠相似,而与蝙蝠科鼠耳蝠属的大足鼠耳蝠（Myotisricketti）、绒鼠耳蝠（Myotisierneg）和毛腿鼠耳蝠（Myotisfimbriatus）的LDH同工酶酶谱明显不同[16-18].这也证实了同属蝙蝠的LDH同工酶在氨基酸成分构成上较为相似,而不同属蝙蝠LDH同工酶在氨基酸构成上差异较大.比较国内外对不同蝙蝠同工酶的研究[7,8,13-15]，可知,普通伏翼的同工酶特点具有明显的物种特异性,并且酶的数量分布与其组织功能密切相关。参考文献[1]冯江,陈敏,李振新,等.八种菊头蝠回声定位声波频率与体型的相关性[J].动物学报,2003,49(1):128-133.[2]JonesG.Scalingofecholocationcallparametersinbats[J].JournalofExperimentalBiology,1999,202:3359-3367.[3]JonesG,T.GordonandJ.Nightingale.Sexandagedifferencesintheecholocationcallsofthelesserhorseshoebat,Rhinolophushipposideros[J].Mammalia,1992,56(2):189-193.[4]吴毅MasashiHARADA.广东五种菊头蝠的核型分析[J].兽类学报,2005,25(2):163-167.[5]VonhofMJ,BarberD,FentonMB,StrobeckC.Ataleoftwosiblings:multiplepaternityinbigbrownbats(Eptesicusfuscus)demonstratedusingmicrosatellitemarkers[J].MolEcol,2006,15(1):241-247.[6]MarkertCL,etal.TheOntogenyofisozymepatternsoflactatedehydrogenaintheMouse[J].DevBiol,1962,5:363-381.[7]黄人鑫,吴霞,姜涛,等.新疆三种无尾两栖类乳酸脱氢酶(LDH)同工酶酶谱的比较研究[J].新疆大学学报(自然科学版),1990,4(7):58-63.[8]ShawR,PrasadR.Starchgelelectrophoresisofenzymesacompilationofrecipes.Biochem.Genet,1970,4:297-320.[9]胡能书,万贤国.同工酶技术及其应用.长沙:湖南科学出版社,1985.[10]冯文和,罗昌蓉,何光昕等.大熊猫尸体组织LDH同工酶盘电泳观察[J].兽类学报,1985,5(3):167-172.[11]陆佩洪,王铭,冯照军.十二种脊椎动物不同组织中乳酸脱氢酶同工酶酶谱的比较研究[J].南京师大学报(自然科学版),1984,4:80-85.[12]屈红,党蕊叶.羚牛、羊、牛血清同工酶的比较研究[J].兽类学报,1985,8(2):113-116.[13]Serba