亚低温治疗对谷氨酸兴奋性毒性影响的研究2

亚低温对神经元谷氨酸兴奋性毒性损伤影响的研究王得文李爱林*（甘肃省永靖县人民医院,731600）【摘要】目的研究谷氨酸(Glutamate,Glu)对神经元凋亡和细胞膜损伤的影响，探讨亚低温对神经元的保护作用。方法神经干细胞诱导分化6天的神经元分为37℃阳性对照组与29℃，31℃，33℃，35℃实验组，分别加入50µmol/L的谷氨酸，37℃阴性对照组不加入谷氨酸。评价神经元的细胞毒性，观察Bax表达的变化，测定甘油(Glycerol,Gly)含量。结果1、Bax表达：29℃亚低温治疗组最高，其次为37℃阳性组，而37℃阴性组最低；上清乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase，LDH）活力和Gly均为29℃组最高，其次为37℃阳性组，37℃阴性组最低；细胞中LDH活力为29℃组最低，其次为37℃阳性组，37℃阴性组最高。2、31℃、33℃和35℃实验组：上清LDH活力、Gly和神经元Bax表达均为37℃阳性组最高，其次为31℃组、33℃和35℃实验组，37℃阴性组最低；细胞中LDH活力为37℃阳性组最低，其次为31℃组，37℃阴性组最高。结论1、谷氨酸是导致神经细胞膜损伤和凋亡的原因之一；31-35℃亚低温治疗可以降低凋亡促进基因Bax的表达，减轻神经元细胞膜的损伤。关键词：亚低温谷氨酸BaxAStudyofCellMembraneDamageofGlutamate-inducedHippocampalNeuronsandtheEffectofHypothermiaonItWangDe-wen,LiAi-lin*(YongjingPeople’sHosptal,YongjingCounty731600,GansuProvince,China;*HuanhuHospital,Tianjin300060,China)【Abstract】ObjectiveTheaimofthisstudywastoinvestigatewhethertheincreaseofGluleadstotheincreaseofGly,theexcessexpressofBax，andthecellmembraneinjury.MethodsGlutamate-inducedhippocampalneuronsapoptosismodelwasestablished.Cytotoxicity(LevelofGlyandLDH)andapoptoticmolecularregulatorBaxweremeasured.Effectofhypothermia(29℃,31℃,33℃and35℃)onapoptosisandcellmembraneinjurywereevaluated.Ascontrol,cellswithoutinductionofapoptosiswereincubatedunderthesameconditiondastheapoptosisgroup.ResultsAteachtemperatureexaminedfrom31℃to35℃,significantdecreasesincytotoxicityandtheexpressofBaxwereobserved,respectively.In29℃group,significantincreasesincytotoxicityandtheexpressofBaxwereobserved.Conclusion:Hypothermia(31-35℃)inhibitedexpressofBaxandcytotoxicity,althoughhypothermiabelow29℃mayinduceapoptosisandcellsmembraneinjuryinintactcells.KeywordHypothermiaGluBax大量研究表明Glu的兴奋性毒性是导致凋亡的重要原因之一[1]。本研究通过体外培养神经元的谷氨酸损伤模型，进一步研究兴奋性毒性对神经元凋亡的影响以及亚低温治疗对Glu损伤神经细胞膜的保护作用。材料和方法一、材料(一)、实验动物:孕14dSD大鼠4只，购自军事医学科学院第四研究所。（二）、试剂:纤维母细胞生长因子-2（FGF-2，Pepretech公司）、表皮细胞生长因子（EGF，Pepretech公司）、Nestin，MAP2，Bax和Bcl2免疫组化试剂盒（中国北京中山公司）。（三）、器材：CO2培养箱(IG150,Jouan公司，法国),倒置相差显微镜(NIKON，日本),三气培养箱（95%氮气+5%氧气+5%二氧化碳，Heraeus公司，德国）。二、实验方法（一）、神经细胞的培养1、鼠胚胎大脑神经干细胞的分离培养：取孕14d的SD孕鼠，无菌处理后取胚胎脑组织，加等体积的0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二钠（EDTA），令其消化分散成单细胞悬液。在IMDM完全培养液中培养神经干细胞。神经干细胞鉴定:神经干细胞鉴定在培养第三代胎鼠大脑海马NSC中干细胞巢蛋白（nestin）免疫荧光染色阳性，神经干细胞呈球体聚合状悬浮生长，细胞团呈圆型，显示细胞正处于未分化生长状态，经nestin一抗和免疫荧光二抗标记呈绿色荧光球体，表明为正常生长的神经干细胞。2、神经干细胞的诱导分化：上述各组经6天培养后，收集细胞，离心弃上清，各组细胞重新悬浮于含10%FBS、N2和BDNF（20μg/L）的IMDM培养液中，接种于24孔板（已涂布明胶），继续培养6天后，用4%多聚甲醛固定30min，进行MAP2免疫组织化学染色，鉴定分化的神经元。3、细胞存活率计算：MAP2阳性率为存活的神经元。通过镜下观察免疫组化染色可清楚区分死亡神经元和正常神经元，这些神经元MAP2染色呈阴性，因此在进行存活神经元计数过程中，选择胞体和突起染色均为阳性并且结构完整的细胞。（二）参照Jiang等[86]的方法，制做Glu损伤模型。神经干细胞分化6天的谷氨酸损伤模型亚低温实验分组如下：37℃阴性对照组（不加入谷氨酸）；37℃阳性对照组（加入50µmol/L的谷氨酸）；29℃实验组（加入50µmol/L的谷氨酸）；同进行的还有31，33，35℃谷氨酸损伤模型亚低温实验，分组情况同29℃实验组。（三）乳酸脱氢酶活力测定上清中LDH的活力(U/L)=（测定管OD值-测定空白管OD值）/（标准管OD值-标准空白管OD值）×标准管浓度(2μmol/ml)×1000ml×测定前样品稀释倍数。细胞中LDH活力(U/gprot)=（测定管OD值-测定空白管OD值）/（标准管OD值-标准空白管OD值）×标准管浓度(2μmol/ml)÷蛋白浓度(gprot/ml)。（四）免疫组化染色（按ABC试剂盒程序）：细胞呈棕黄色为阳性，阴性则为胞浆无色。阳性细胞计数：200×光镜下，随机选取六个区域，每个区域用目镜网格测微尺计算阳性细胞密度，以阳性细胞/网格范围内的细胞总数，分别计数细胞总数阳性细胞数,以百分率计算阳性细胞数,每组数据计算均数与标准差。（五）、统计方法：用SPSS11.5统计软件包进行处理。各种生化成分及比率的组间差异显著性用单因素方差分析（one-wayANOVA）,组内两两比较用S-N-K法。结果一、正常培养的海马神经元（一）、神经微管相关蛋白2（MAP2）免疫组化染色：培养6天的神经元MAP2染色，可见胞浆被染成棕黄色，阳性率达18.21-22.34%。（二）、在相差显微镜下观察谷氨酸对体外培养海马神经元形态学的影响。37℃阳性组观察发现，细胞体积变小，染色质凝聚在核膜下呈半月状，部分轴突增粗甚至发生断裂，细胞光晕减弱或消失，细胞膜增厚、粗糙,部分细胞死亡崩解。二、氨酸对神经元的损伤作用及亚低温治疗对Bax、LDH和Gly的影响。(一)、29℃亚低温治疗对LDH、Gly和Bax表达的影响(表1)：Bax表达29℃亚低温治疗组最高，其次为37℃阳性组，而37℃阴性组最低。上清LDH活力和Gly均为29℃组最高，其次为37℃阳性组，37℃阴性组最低；细胞中LDH活力为29℃组最低，其次为37℃阳性组，37℃阴性组最高。(二)、31℃实验组亚低温治疗对LDH、Gly和Bax表达的影响(表2)：上清LDH活力、Gly和神经元Bax表达均为37℃阳性组最高，其次为31℃组，37℃阴性组最低；细胞中LDH活力为37℃阳性组最低，其次为31℃组，37℃阴性组最高。(三)、33℃实验组亚低温治疗对LDH、Gly和Bax的影响(表3)：上清LDH活力、Gly和神经元Bax表达均为37℃阳性组最高，其次为33℃组，37℃阴性组最低；细胞中LDH活力为37℃阳性组最低，其次为33℃组，37℃阴性组最高。(四)、35℃实验组亚低温治疗对LDH、Gly和Bax的影响(表4)：上清LDH活力、Gly和神经元Bax表达均为37℃阳性组最高，其次为35℃组，37℃阴性组最低；细胞中LDH活力为37℃阳性组最低，其次为35℃组，37℃阴性组最高。讨论一、Glu损伤模型的建立脑损伤体外模型能消除在体时各种复杂因素的影响,观察某种特定细胞的病理生理变化，提供一些在体研究不能得到的信息,因此近年来倍受关注。为探讨兴奋性毒性物质引起脑组织特定细胞膜损伤的机制及亚低温的治疗作用，本实验采用Meade等的Glu损伤模型[2]。细胞系对生长条件要求较低，易于培养，可以冻存和无限传代。细胞系持续分化的特性表明它们的基因表型和蛋自表达已与正常的细胞显著不同，因此本研究未采用细胞系作为研究对象。神经元是终末分化细胞，分离纯化十分困难，采用神经元和胶质细胞混合培养和MAP2免疫组化对培养细胞鉴定的技术，既可研究Glu对神经元的损伤作用同时混合培养又可模拟体内真实的环境。用新生鼠直接进行神经元培养在分离过程中可能造成细胞损伤且获得的神经元数量较少，故本研究首先用胎鼠进行神经干细胞的培养，然后通过诱导分化获得大量混合培养的神经元。文献报道神经干细胞诱导分化为神经元后48h不仅在体外生长较为旺盛，胞体和突触形成较为完善，而且对Glu较为敏感，因此，本实验选择培养2天的神经元进行观察。本研究成功制作了Glu诱导的凋亡模型。形态学观察发现，37℃阳性组海马细胞神经元与37℃阴性神经元相比较，细胞体积变小，染色质凝聚在核膜下呈半月状，部分轴突增粗甚至发生断裂，细胞光晕减弱或消失，部分细胞死亡崩解。37℃阳性Bax阳性细胞率显著高于37℃阴性组，支持镜下结果，证明Glu损伤的神经元凋亡促进基因表达活跃。二、Glu的兴奋性毒性及亚低温治疗的保护作用近年研究表明，在退行性疾病(如阿尔兹海默氏病、帕金森氏病)、脑缺血性损伤中和脑创伤后凋亡都参与了脑细胞死亡的机制[3]。Bax基因对细胞凋亡有促进作用，本研究选择Bax蛋白表达进行研究，以期进一步深入了解亚低温治疗对凋亡的影响。本研究发现Glu损伤后的神经元bax表达显著高于无Glu损伤的神经元，而31℃、33℃和35℃亚低温治疗可以显著减少因Glu的兴奋性毒性所致的bax表达，提示亚低温治疗通过抑制bax表达而减少损伤神经元的凋亡。但29℃低温治疗2天后，bax表达高于未治疗的Glu损伤的神经元。对于亚低温治疗的安全温度窗不同作者看法不同，有作者[4]通过剥夺血清的方法诱导海马神经元凋亡，也发现与本实验类似的结果，并认为29℃低温治疗2天可产生冻伤作用，导致细胞凋亡。因此作者认为应慎用29℃的亚低温治疗，并对治疗温度进行更深入的研究。乳酸脱氢酶的释放率可以作为细胞膜损伤的标志。正常情况下释放很少，当细胞膜的通透性增高或完整性丧失时，LDH扩散进入胞外介质。对31，33和35℃组上清中LDH的测定表明，37℃阳性组LDH最高，其次为31，33和35℃亚低温治疗组，而37℃阴性组最低，对细胞内LDH的测定相反，37℃阳性组LDH明显降低，37℃阴性组最高，Gly的变化与LDH相似，表明谷氨酸的兴奋性毒性是造成细胞膜损伤的原因之一，亚低温治疗对谷氨酸的兴奋性毒性造成的细胞膜损伤具有保护作用。29℃实验组出现了