产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离鉴定与育种

题目产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离、鉴定与育种摘要首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行微波诱变，筛选出产量高、性状优良的正突变菌株，并用正交实验的方法，从发酵培养基三个主要成分（玉米粉、黄豆饼粉、酵母粉）对产酶条件进行优化，实验最后利用多相分类的方法对筛选出的正突变菌株做了菌种鉴定，初步确定为短芽孢杆菌。引言淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途[1]。现在淀粉酶主要来源于植物和微生物[2]并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事[3]。本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，通过诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。一、研究方法1、实验材料：河北大学生命科学学院院前的土壤2、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培养皿、培养基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、德汉氏小管、直尺、记号笔等。诱变箱：微波炉（E30E-3）离心机、721分光光度计：3、培养基和试剂（1）培养基：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、种子培养基[4、7]、出发培养基[4、7]、糖发酵培养基、明胶培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基、蛋白胨液体培养基（吲哚实验）、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、M．R实验）、硝酸盐液体培养基、酪素培养基（2）试剂：碘液、孔雀绿染液、番红染液、乙醚、吲哚试剂、KOH、α-耐酚、甲基红、格里斯氏试剂、锌粉、3%H2O2、柠檬酸缓冲液、1%淀粉溶液、3,5-二硝基水杨酸（注：所用药品均为分析纯）。4、实验方法（1）细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-4、10-5、10-6分别涂布到淀粉培养基上，37℃倒置、过夜培养，影印，将碘液加到淀粉平板上，记录出现水解圈的单菌落的H/C值[5]。将出现水解圈的菌落进行芽孢染色，显微观察菌种形态。保菌供下次实验用。（2）微波诱变[6]：将新鲜斜面上的菌种转接到液体的牛肉膏蛋白胨培养基中37℃下培养18-24h。将菌液离心、洗涤、稀释，在一定功率下分别诱变30s、60s、90s，稀释菌液并涂布到淀粉培养基平板上，37℃下过夜培养，分别测水解圈的H/C值，将正突变的菌种保存到斜面培养基上。（3）高产菌株发酵条件的优化[7]：通过正交试验对高产菌的发酵条件进行优化，建立高产菌株的最佳摇瓶发酵条件。将诱变得到的菌种接种到种子培养基瓶中培养12-16h，之后，将种子瓶中的菌液以5%的接种量分别接种到出发培养基和优化培养基中，发酵18-24h后，用DNS法测酶活及制麦芽糖-OD标准曲线，确定最佳发酵条件。水平实验因素玉米粉A（g/L）黄豆饼粉B（g/L）酵母粉C（g/L）1818229224311235试验号因素ABCD111112122231333421235223162312731328321393321(4)活性菌株的鉴定[8]：利用多相分类的方法对所分离的菌株进行鉴定：形态鉴定：个体和群体形态鉴定生理生化反应：将诱变得到的正突变菌株进行以下反应：糖发酵实验、甲基红实验、V.P实验、柠檬酸盐利用实验、吲哚实验、H2S实验、硝酸盐还原实验、明胶水解实验、表2不同处理的试验结果表1实验因素与水平过氧化氢酶实验、酪素水解实验、耐盐实验。（注：各实验所用培养基及试剂见附录）二、研究结果和分析1、显微镜观察芽孢染色，可知分离得到的为芽孢杆菌。2、H/C值（1）在分离芽孢杆菌时，影印之后水解圈粘连在一起，无法准确测得H/C值。分析：可能是所采土样中产淀粉酶的芽孢杆菌含量较多，涂平板之前稀释倍数不够导致单菌落过于密集，水解圈粘连。（2）紫外诱变后的平板影印：单菌落透明圈直径/mm(H)菌落直径/mm(C)H/C①4.83.01.6②6.43.51.8③15.84.83.3④16.04.93.3⑤11.84.52.6⑥9.84.02.5⑦17.05.03.4分析：通过结果，可看出经过紫外诱变后，有的菌株产酶活能力有所提高，有的减小，筛选产酶活能力最高的菌株，保存供后续试验使用。3、正交试验优化发酵条件（1）、麦芽糖标准曲线图1麦芽糖标准曲线y=0.5327x+0.0098R2=0.98450.0000.2000.4000.6000.8001.0001.2000.00.51.01.52.02.5麦芽糖量（mg）OD（540nm)分析：标准曲线的精确度不高，原因主要有三点：①、最后所测三个OD值都超过了0.7，显著偏大，可能是稀释倍数不够所致；②、本实验所用的分光光度计使用年限已久，难免会造成测量结果有误差；表3透明圈直径（H）和菌落直径（C）及比值③、由于操作失误，忘记每个试管做平行测量，造成结果不精确。（2）、酶活力的测定试验号对照出发123456789OD54000.2350.3750.5140.3800.5150.7780.6150.8260.8330.855麦芽糖含量（mg）00.4230.68560.9470.6950.9481.4421.1361.5321.5451.578分析：依据标准曲线，计算出各个OD值对应的麦芽糖含量，其中，5、7、8、9四个试验号对应的测量结果误差太大，不能作为比较酶活大小的依据。（3）、正交试验结果由于DNS法测酶活时，接近一半的结果误差太大，因此正交试验失败，无法得到菌株的最佳发酵条件。4、活性菌株鉴定[8]（1）、菌落群体形态观察：表面湿润、有不规则突起，菌落直径大概2-3cm。（2）、生理生化反应结果：①、糖发酵培养基颜色由紫变黄，无气泡产生，结果呈阴性。②、甲基红实验：滴加甲基红染液后变红，结果呈阳性。③、V.P实验：结果不变红，呈阴性。④、柠檬酸盐利用实验：无变蓝，结果呈阴性。⑤、吲哚实验：无玫瑰红，结果呈阴性。⑥、H2S实验：无变黑，结果呈阴性。⑦、硝酸盐还原实验：滴加格里斯试剂后，培养基颜色变为玫瑰红，结果呈阳性。⑧、明胶水解实验：结果呈阴性。⑨、过氧化氢酶实验：有气泡产生，结果呈阳性。⑩、酪素水解实验：出现水解圈，结果呈阳性。⑾、耐盐实验：盐浓度为3%、5%、7%的培养基中均有生长的菌落，其中盐浓度为3%的培养基中菌浓度最高，7%的最少。结果为阳性。综合上述实验结果，初步确定所得菌株为短芽孢杆菌。三、讨论本实验的设计方案具有一定的理论依据，如果操作得当，各方面条件满足，会得到产淀粉酶的活性芽孢杆菌高产菌株，及该菌株的最佳摇瓶发酵条件。但操作过程存在很多缺陷，导致结果失败，主要问题有：1、分离芽孢杆菌时，稀释度不够导致水解圈粘连；2、DNS法测OD值时，一部分数据显著偏大，可能是稀释倍数不够所致；3、本实验所用的分光光度计使用年限已久，难免会造成测量结果有误差；4、DNS法测OD值时，由于操作失误，忘记每个试管做平行测量，造成结果不精确；表4DNS法测正交试验后各条件下麦芽糖含量5、由于考虑到时间的限制，实验过程中芽孢杆菌分离时的复筛及突变后的复筛都没做，若要得到精确可靠的实验数据，应该操作完善。此外，诱变存在很大的不确定性，为使诱变效率提高，运用分子生物学技术对菌株进行基因操作和定向改造，会使菌株选育朝着快捷、高效的方向发展[9]。以上几点可以作为今后该实验改进的几点建议，及操作过程中应注意的问题。四、结论经过初筛，从土壤中分离得到产淀粉酶的芽孢杆菌；微波诱变之后，经过筛选，得到正突变菌株；进一步正交优化发酵条件，探寻最佳摇瓶发酵条件；最后利用多相分类鉴定可知：从土壤中能筛选出产淀粉酶的活性短芽孢杆菌。五、参考文献[1]张双民.土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化.土壤肥料，200602[2]唐嘉，陈朝银，赵声兰，等.一种初筛产胞外淀粉酶菌株的简化方法[A].生物加工过程，2008，06（01）：01[3]燕卫东.贫瘠土壤中淀粉酶产生菌株的筛选.生产与科研实验，2008（12）：73[4]高宏.枯草芽孢杆菌纤溶酶高产菌株选育、发酵条件优化及其分离纯化.南京农业大学，食品微生物及其生物技术，200609：13[5]沈萍，陈向东．微生物学实验．北京：高等教育出版社，2007，187-190[6]林云萍.枯草芽孢杆菌B68发酵条件及诱变选育的研究.华南热带农业大学硕士学位论文，200605：12[7]关志炜.枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶的研究.食品科学，200706：24-30[8]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.[9]刘永乐，刘泽军，俞健.一株耐酸性α淀粉酶高产芽孢杆菌的选育和鉴定.中国食品学报，200909（06）六、附录（一）、培养基的配制1、淀粉培养基蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000mL，琼脂15~20g，121℃灭菌20min2、牛肉膏蛋白胨培养基蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，蒸馏水1000mL，琼脂15~20g，121℃灭菌20min，pH7.0~7.23、种子培养基蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl1%，琼脂2%，可溶性淀粉0.25%4、出发培养基玉米粉10g，淀粉15g，豆粉20g，酵母粉3g，KH2PO40.3g，ZnSO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，pH7.05、糖发酵培养基蛋白胨水培养基1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1.6g溴甲酚紫溶解到100mL乙醇中）1~2mL，pH7.6，另配20%糖溶液，蛋白胨水121℃灭菌20分，20%糖溶液112℃灭菌30min，分别灭菌后再混合。6、明胶培养基牛肉膏蛋白胨液100mL，明胶12~18g，pH7.2~7.4，在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌溶化后调pH，121摄氏度灭菌30min。7、柠檬酸盐培养基NH4H2PO41g，K2HPO41g，NaCl5g，MgSO40.2g，柠檬酸钠2g，琼脂15~20g，蒸馏水1000mL，1%溴香草酚蓝乙醇液10mL，将上述各成分加热溶解后，调pH6.8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色，分装试管，121摄氏度灭菌20min后制成斜面。8、醋酸铅培养基pH7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂100mL，硫代硫酸钠0.25g，10%醋酸铅水溶液1mL，将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基加热溶解，待冷却至60摄氏度加入硫代硫酸钠调pH7.2分装于三角瓶中，115摄氏度灭菌15min。取出后待冷至55~60摄氏度，加入醋酸铅水溶液，混匀后倒入灭菌试管中。9、吲哚培养基蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH7.6，121摄氏度灭菌20min10、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、M．R实验）蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO42g，蒸馏水1000mL，将上述各成分溶于水中，调pH7.0~7.2，分装试管，112摄氏度灭菌30min。11、硝酸盐液体培养基MgSO40.05%，K2HPO40.05%，KNO30.1%，蔗糖2%，NaCl0.05%，Ph7.2，115摄氏度高压蒸汽灭菌30min。12、酪素培养基A液：Na2HPO4·7H2O1.07g，干酪素4g，加适量蒸馏水，并加热溶解B液：KH2PO40.36g，加水溶解A、B液混合后，加入酪素水解液0.3mL，加琼脂20g最后用蒸馏水定容至1000mL。酪素水解液的配制：1g酪蛋白溶于碱性缓冲液中，加入1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL加水至100mL，30摄氏度水解1h。用于配制培养基时其用量为1000mL培养基加入100mL水解液。13、耐盐试验所用培养基蛋白胨10g，氯化钠（分别为30g、50g、70g），牛肉膏3g，蒸馏水1000mL，琼脂15~20g，121℃灭菌20min，pH7.0~7.2（二）、试剂1、碘液碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。先用少量（3~5mL）蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片待碘全溶解后，