中药抗过敏针对呼吸道变应性疾病作用机制的实验研究

中药复方“别敏”治疗呼吸道变应性疾病作用机制的实验研究张素琴1，张新民，胡国让2，刘闰红1，陈伟华1(1．复旦大学附属华山医院中西医结合研究所，上海200040；2．澳大利亚悉尼大学Concord医院免疫与变态反应科)本文档包含专有信息，受版权保护。未经书面形式授权许可，不得以任何形式或电子、机械、磁学、光学、化学和人工等其它方式复制、传播、转录本文件的任何部分，也不得将任何部分储存于检索系统中或翻译成任何语言。予追求法律责任[摘要】目的：探讨中药复方。别敏”治疗呼吸道变应性疾病的作用机制。方法：将豚鼠分为5组：正常组，模型组，“别敏”高、中、低剂量组。于实验第1天用10％卵蛋白腹腔注射致敏豚鼠，于第15天用5％卵蛋白雾化吸人诱发哮喘发作，观察各组豚鼠引喘潜伏期，外周血、支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞和IL-5水平变化，脾淋巴细胞增殖反应及血清皮质酮水平变化。结果：模型组豚鼠外周血和BALF中嗜酸性粒细胞、血清IL-5以及血清皮质酮水平明显高于正常组(P0．05)。中药复方“别敏”能够明显延长致敏豚鼠引喘潜伏期(P0．05)，抑制外周血及BALF中嗜酸性粒细胞水平升高(P0．05)，抑制脾淋巴细胞的增殖反应特别是高剂量组(P0．05)，降低血清IL-5水平尤其是高、中剂量组(P0．05)。结论：中药复方“别敏”能有效防治呼吸道变应性疾病，其机制可能通过调节淋巴细胞功能，降低IL-5水平，降低气道和外周血嗜酸性粒细胞的数量而起作用。【关键词】变态反应；呼吸道；嗜酸性粒细胞；白介素．5；别敏【中图分类号】R285．5[文献标识码】B【文章编号】1005．9903(2007)04-0037．04ExperimentalStudyoftheChineseHerbalFormulationBiminneinTreatingAirwayAllergicDiseaseZHANGSu-qinl，ZHANGXin-min¨，HUGuo-rang，LIURun-hong，CHENWei-hnal(1．HuashanHospitalAffiliatedtoFudanUniversity，Shanghai，200040，China；2．ConcotdHospital，SydneyUniversity，Sydney，Australia)【Abstract]Objective：Toinvestigatethemechanism。oftheChineseherbalformulationBiminneintreatingairwayallergicdisease．Methods：WeusedguineapigmodelofallergicdiseasetostudytheeffectsoftheChineseherbalformulationBiminneontheairwayallergicdisease．Theguineapigsweredividedto5groups：normalgroup，modelgroup，hiSh—dosegroup，middle·dosegroup，low-dosegroup．Onday1theguineapigsweresensitizedbyinjectingintraperitoneallywith10％ovalbumin(OVA)，andonday15thesensitizedguineapigsweresubjectedto5％OVAinhalationchallenge．ThenweobservedtheindexsuchastheeosinophilandIL-5levelsinbloodandbronchialairwaylavagingfluid(BALF)，corticostemidlevelinbloodandthespleencellproliferationresponsiveness．Results：Comparedwithnormalgroup，theeosinophilnumberinbloodandBALF。andIL-5levelinbloodincreasedsignificantlyinmodelgroup(P0．05)，ButBiminnecouldsignificantlyprolongthetimewhentheasthmaattackhappened，attenuatedtheincreaseintheeosinophilandIL-5levels，especiallythehige—doseandmiddle-dosegroups(P0．05)，andalsosuppressedtheproliferationofspleencells，especiallythehige—dosegroup(P0．05)．Conclusion：Theresultssuggestthat‘theChineseherbalformulationBiminnehassomeantiasthmaticeffect，partlymediatedbyattenuatingeosinophilandIL-5levelsandsuppressingthespleencellproliferationinOVA—sensitivedguineapigs．ThustheChineseherbalformulationBimnnemaybeusefulinpreventingandtreatingallergicdisease．[Keywords]allergicreaction；airway；eosinophil；IL-5；Biminne【收稿日期】2006-10-23【基金项目】上海市科委攻关项目(02DZl9128)【通讯作者】张新民(021)624899--6517；呼吸道变应性疾病包括变应性鼻炎和哮喘，两者在病因学、发病机制和病理改变等方面均极为相似，发病率均有逐年增加趋势，严重影响人类的健康和生活质量¨1。从中医药中开发出有效治疗呼吸道变应性疾病的药物前景广阔。中药复方别敏由黄芪、防风、黄芩、淫羊藿、五味子等11味药材按一定比例制作而成，主要功效为温肾益气、祛风散邪。在澳大利亚进行了严格随机、双盲对照临床试验显示：中药复方别敏能明显改善变应性鼻炎患者鼻痒、喷嚏、流涕、鼻塞等临床症状，且能降低患者血清总LgE水平晗。本研究进一步利用哮喘豚鼠模型，观察外周血和BALF中嗜酸性细胞数和IL-5水平变化，脾淋巴细胞增殖反应及血清皮质酮浓度变化，探讨“别敏”复方在治疗呼吸道变应性疾病中抑制炎症及调节整体内分泌免疫功能中的作用。1材料与方法1．1材料1．1．1实验动物健康雄性豚鼠75只，由复旦大学上海医学院实验动物部提供，普通级，体重(200-250)s，合格证号：SCXK沪2002-0011。1．1．2实验试剂别敏胶囊由澳大利亚悉尼大学提供(黄芪5．52g，防风、地黄、黄芩、银杏叶、淫羊藿、补骨脂各4．6g，黄精、五味子、自芷各3．68g，乌梅肉1．84g，制成6g浸膏粉，分装10粒胶囊，成人每天分2次服用；利用高效液相测定法，测定黄芪甲苷淫羊藿总黄酮，黄芩甲苷的含量，制定其标准；利用气相色谱测定法，监测各重金属离子，进行质量控制)，卵清蛋白(OVA，II级，Sigma)，Hanks液、1640．RPMI(Sigma公司)，胎牛血清(ClBCO)；淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)，3H．TdR(上海原子能研究所)，闪烁液PPO、POPOP(国药集团化学试剂有限公司)，乙酸(国药集团化学试剂有限公司)，瑞士染液(由我院检验科提供)，豚鼠血清皮质酮ELISA试剂盒(Rapidbiolab，USA)，豚鼠IL-5ELISA试剂盒(Bapidbiolab。USA)。1．1．3实验仪器超声雾化器(上海亿圣科技有限公司)，多头细胞收集器(绍兴卫星医疗设备制造有限公司，原上海医科大学监制)，液体闪烁计数仪(LKBWALLAC)，酶标仪(MQX200，Bio．IEK公司)，离心机(Centrifuge5804，Eppendorf公司)。1．2方法1．2．1分组与模型建立75只雄性豚鼠随机分为5组即正常对照组、模型组、低剂量别敏组、中剂量别敏组、高剂量别敏组，每组15只。模型制备参照文献【3】，即模型组、低、中、高剂量别敏组豚鼠在实验第1天用10％卵蛋白生理盐水溶液1mL腹腔注射致敏动物，于实验第15天用5％卵蛋白生理盐水溶液恒压雾化吸入，诱发哮喘发作。正常对照组用生理盐水溶液腹腔注射和雾化吸人。1．2．2给药给药时间从动物致敏后第2天开始到雾化吸入前1天结束，共13天。高剂量别敏组(2g／I【g体重)，中剂量别敏组(1g／ks)，低剂量别敏组(O．5g，kg体重)，灌胃体积为2mL／只，正常对照组和模型组灌胃等体积饮用水。1．2．3引喘实验第15天，即在给药结束后1天，将豚鼠放人一密闭容器中，用5％卵蛋白生理盐水溶液向容器内恒压喷雾30S，观察和记录在3min内豚鼠发生哮喘的潜伏期，实验对照组用生理盐水雾化吸入。如豚鼠在3min内未发生呼吸困难则引喘潜伏期按180S计算(引喘潜伏期是雾化吸入开始到豚鼠发生点头样呼吸困难时的时间)。1．2．4血样采集及检测豚鼠引喘实验结束后用2％戊巴比妥钠麻醉，开胸心脏采血。用毛细吸管精确吸取20μL血液加到380μL白细胞稀释液(2％稀醋酸)中进行白细胞计数。并取血液涂片用瑞氏染色进行白细胞分类计数，油镜下计数200个细胞，计算嗜酸性粒细胞百分比。剩余的血液放置于试管中，4℃1500r／min离心10min后取上清，分装后冻存于一20℃冰箱，待测血清IL-5和皮质酮水平，测定过程严格按照试剂盒说明书进行。1．2．5BALF标本采集及检测豚鼠引喘实验结束后用2％戊巴比妥钠麻醉，切开颈部皮肤，钝性分离气管，暴露气管，剪一切口，用聚氯乙烯管从切口朝胸腔方向插入气管，聚氯乙烯插管连接注射器，用3mL生理盐水灌人后，立即回抽，回收灌洗液，共重复灌洗3次，回收率80％。将BALF于4℃，l500r／min离心10min，收集上清，分装后冻存于一20℃，待测IL-5水平。细胞沉渣用0．5mL生理盐水混悬，镜下计白细胞总数；并进行涂片，瑞氏染色后在油镜下计数200个细胞，进行嗜酸性粒细胞计数。IL-5的测定严格按照试剂盒说明书进行。1．2．6脾淋巴细胞增殖反应无菌取脾，淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，常规用10％FBS．RPMI-1640培养液制备5×lo'／mL的细胞悬液，于96孔培养板中，每孔加入100汕脾细胞悬液，每鼠2个复孔。每实验孔加植物血凝素(PHA)5Pg，对照孔加等体积培养液饱和湿度，5％C02，37℃培养48h，终止培养前18h每孔加1vtCi3H．TdR。用多头细胞收集仪收集细胞于膜片上，膜片干燥后，置测量杯中，加3mL闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每min脉冲数(cpm)，计算刺激指数SI=实验孔cpm／对照孔cpm。1．3统计学处理采用SPSSll．5统计软件，进行单因素方差分析，方差不齐时采用秩和检验，组间两两比较采用口检验，实验数据用(露±s)表示，(P0．05)差异有统计学意义。2结果2．1别敏对致敏豚鼠引喘潜伏期的影响见表1。高剂量别敏组和中剂量别敏组引喘潜伏期较模型组明显延长(P0．05)。正常对照组豚鼠雾化吸人过程中未发现有呼吸困难表现。表1“别敏”对致敏豚鼠引喘潜伏期的影响(X±S,n=15)组别剂量(g/kg)引喘潜伏期时间(s)模型组——81±40.07别敏高剂量组2.0123.53±53.73别敏中剂量组1.0117.44±48.34别敏低剂量组0.5101.4±53.86注：与模型组比较P0，05，2’P0．01，下同。2．2别敏对致敏豚鼠外周血、BALF中自细胞总数和嗜酸性细胞计数的影响见表2。与正常对照组相比，模型组外周血嗜酸性细胞明显升高，BALF中白细胞总数和嗜酸性细胞显著升高，差异均有统计