中药化学成分的研究的一般方法

中药化学成分的研究的一般方法新疆大学生命科学与技术学院生物资源植物实验室古丽扎尔·阿布都克依木2010.11.1中药化学成分研究概况及发展趋势历史中国：公元12世纪，使用大麦发芽制造饴糖；明代李时珍《本草纲目》中记述五倍子“看药上长起长霜，药则已成”，长霜即为没食子酸结晶，另外还记述了升华法制备纯化樟脑的过程。古代我国处于世界领先地位。近代至新中国成立之前，我国中医药发展几乎停滞，直到20世纪70年代以后才有较大发展。日本：近几十年发展迅速，对众多常用中药的化学成分进行了较深入的研究，取得了一大批领先成果。如人参、黄芪、葛根、芍药、柴胡等。中药化学研究概况：建国以来我国从中药或天然药物中研制开发的新药有40余种，例如青蒿素、川芎嗪、靛玉红等。我国作过比较深入的化学成分或药学研究的中药有200余种有200余种有效成分被制成500余种制剂已用于临床。分离出的有效成分种类以生物碱、二萜、三萜、黄酮类居多。20年代，我国开始研究麻黄碱（左旋麻黄碱），使麻黄碱成为世界性常用药物。麻黄碱具有兴奋中枢、收缩血管、增强汗腺、唾液腺分泌、缓解平滑肌痉挛等作用，是麻黄平喘的主要成分。30年代发现了延胡索乙素（消旋四氢巴马丁）、汉防己甲素（粉防己碱）、汉防己乙素（防己诺林碱），均有镇痛作用。40年代陆续生产了麻黄碱、芦丁、洋地黄毒苷、咖啡因、小檗碱、山道年、狄戈辛、西地兰、阿托品、长春新碱等。70年代以后羟基喜树碱—抗癌高三尖杉酯碱—抗白血病天花粉蛋白—引产青蒿素、蒿甲醚、双氢青蒿素—抗疟中药化学研究的发展趋势更注重以活性为指标追踪有效成分的分离，我国尤为重视建立符合中医药理论的活性指标，更能体现中医药特色。更注重多学科的密切配合（如药理学、药代动力学、分子生物学等），吸收新技术、新方法并结合中医药理论和传统经验。目前，对中药复方有效成分的研究方法有两种，一是将化学成分分离和药理活性测试分阶段交替进行。另一是以简单、灵敏、可靠的活性测试方法为向导，紧密结合已建立的能够确切反映复方疗效的动物模型，对分离的每一个部位进行活性定量评估，追踪活性部位，从而分离鉴定出活性成分。中药化学成分的研究方法中药化学成分的主要类型：（一）从物质基本类型分：有机物、无机物。（二）按元素组成、结构母核分：生物碱、黄酮、苷、醌、甾、萜、苯丙素等。（三）按酸碱性分：酸性、碱性、中性。（四）按溶解性分：非极性（亲脂性）、中极性、极性（亲水性）（五）按活性分：有效成分、无效成分具有生物活性，能用分子式和结构式表示，并具有一定的物理常数的单体化合物，称为有效成分。与有效成分共存的无生物活性的成分称为无效成分。（六）按生合成途径分：一级代谢产物（如糖、蛋白质）、二级代谢产物（如生物碱、黄酮、皂苷）。中药化学成分提取分离方法的基本原理及应用一、基本概念1、提取：利用适当的溶剂或方法，将所要成分尽可能从原料中完全提出的过程。2、分离：将提取物中所含的各种成分一一分开，并将得到的单体加以精制的过程。二、提取方法水溶剂提取法：溶剂亲水性有机溶亲脂性有机溶水蒸气蒸馏法超临界流体萃取法（SFE）升华法压榨法（一）溶剂提取法1、原理根据中药中各种成分的溶解性不同，选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，将所需成分从药材组织中溶解出来的一种提取方法。选择溶剂依据相似相溶原理。2、选择溶剂的要点对所要成分溶解度大沸点适中容易回收低毒安全中药化学成分中，萜、甾等大环、稠环化合物极性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等极性溶剂中；酸碱性成分因存在状态不同溶解性不同。最常用的溶剂为乙醇。3、溶剂的分类强极性溶剂：水亲水性有机溶剂：能与水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）亲脂性有机溶剂：不与水任意混溶，可分层（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、环己烷、石油醚）常用溶剂的极性大小顺序：石油醚四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇（甲醇）水4、化合物的结构与亲水性、亲脂性的关系（1）分子结构中亲水性基团（羧基、羟基、氨基）越多，极性越大，亲水性越强，反之则亲脂性越强。（2）分子中非极性部分越大，碳链越长或结构越大，则亲脂性越强。（3）结构母核相同的成分，分子中功能基的极性越大，或极性功能基数量越多，则整个分子的极性越大，亲水性越强，亲脂性越弱。5、溶剂的选择(1)水：为价廉、易得、使用安全的强极性溶剂。适于提取无机盐、糖、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类等。(2)亲水性有机溶剂：以乙醇最常用。高浓度提取亲脂性成分，低浓度提取亲水性成分。(3)亲脂性有机溶剂：具有较强的选择性，对挥发油、油脂、叶绿素、树脂、内酯、某些生物碱及一些苷元均可提取出来。优缺点：沸点低，浓缩回收方便，但易燃、有毒、价贵，穿透力差。（二）水蒸气蒸馏法适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的有效成分的提取。挥发油、小分子生物碱、酚类、游离醌类等。（三）超临界流体萃取法最常用的是二氧化碳超临界萃取法，环保、成本低、提取分离一步完成。分子的极性、沸点和分子量的大小与其在二氧化碳超临界流体中的溶解性密切相关。（四）升华法（五）压榨法三、分离精制方法（一）溶剂法（二）沉淀法（三）分馏法（四）膜分离法（五）结晶法（六）色谱分离法（一）溶剂法1、酸碱溶剂法（1）酸溶：有机碱性成分可与无机酸成盐而溶于水。（2）碱溶：具有羧基，用碳酸氢钠；具有酚羟基，用氢氧化钠；具有内酯或内酰胺结构的成分可被皂化而溶于水。2、溶剂分配法原理：利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数不同而达到分离的方法。各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。一般采用全量多次分配提高萃取效率。需要注意的是防止乳化。溶剂的选择：对于分离极性较大的成分，用正丁醇-水；分离中等极性成分，用乙酸乙酯-水；分离低极性成分，用氯仿（或乙醚、石油醚等）-水。所用装置：分液漏斗、连续液-液萃取装置、液滴逆流层析装置。（1）系统溶剂萃取法：常用来粗分，是将总提物分散于水中，依次用石油醚（或环己烷）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别减压回收溶剂得到相应极性的成分。（2）逆流连续萃取法利用两相溶剂比重不同可自然分层和分散液滴穿过连续相溶剂时发生传质的原理，用一根或数根萃取管制成逆流连续萃取装置。管内的瓷环，增加液滴上升的路程和在连续相中停留的时间，更重要的是上升的液滴因撞击填充物而被分散，扩大了两相溶剂萃取的接触面积，使更萃取完全。优点：克服了分液漏斗多次萃取和易乳化的麻烦。（3）逆流分布法（CCD）对性质相似的异构体或同系物分离效果好。基本原理仍是利用混合物中成分在两种不相混溶的溶剂中分配系数的不同，经过在两相溶剂中多次转移，而使它们达到分离的目的。（4）液滴逆流层析法（DCCC）是在逆流分布法基础上发展的高分离效能的逆流分布法，分离管有100~1000根，互相串联，上行法时，分离管内充满重相作为固定液相，利用泵将轻相（移动相）带着样品液进入分离管，形成液滴通过分离管，流出的移动相通过检测，分部收集。溶剂分配法中溶剂系统的选择：两相溶剂不相混溶，混合物中各单一成分在溶剂系统中的分配系数差别越大越好。分离酸碱两性化合物时，缓冲液是很好的溶剂。操作注意：（1）先将两相溶剂相互充分饱和。（2）采用等体积两相溶剂的方式。（3）欲分离混合物的浓度不宜过高。（二）沉淀法1、酸碱沉淀法：例如：生物碱、黄酮、蒽醌2、专属试剂沉淀法：例如：雷氏铵盐沉淀季铵碱、胆甾醇沉淀甾体皂苷；明胶沉淀鞣质。3、分级沉淀法：改变加入溶剂的极性或数量使沉淀逐步析出的方法。例如：多糖、蛋白质的水溶液，分次加乙醇，使含醇量逐步提高，则可得到分子量由大到小的多糖、蛋白质；皂苷的乙醇液，分次加入乙醚或乙醚-丙酮，可按极性从小到大逐步沉淀。4、铅盐沉淀法中性醋酸铅：与酸性或酚性物质沉淀碱性醋酸铅：除以上物质外，还可沉淀具有醇羟基、酮基、醛基结构的物质。脱铅：通入硫化氢法；中性硫酸盐法；阳离子交换法。5、盐析法在混合物的水溶液中，加入无机盐（常用的是NaCL，其它还有Na2S、MgSO4、NH4SO4）至一定浓度或达到饱和，使某些成分沉淀析出或用有机溶剂萃取出而达到分离的目的。（三）分馏法利用混合组分中各成分的沸点不同而分离的一种方法。用于液体混合物的分离。（四）膜分离法利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对混合物溶液进行分离、分级、提纯和富集的方法。反渗透、超滤、微滤、电渗析及传统的透析法均为膜分离技术。原理是大分子不能透过膜而被截留，小分子能透过膜，使分子大小不同的物质得到分离。关键是选择适宜的膜。（五）结晶法1、结晶的条件（1）溶剂：选择合适的溶剂对结晶的形成是关键。合适的溶剂应对欲分离的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热溶解度一致；沸点要适中；不与被分离成分产生化学反应。选择溶剂依据“相似相溶”原理。（2）温度通常在加温的情况下，溶解过滤，除杂，浓缩，放冷。最合适的结晶温度5~10度。（3）时间一般3~5天或更长时间。（4）浓度一般是多一些溶剂，放置使其慢慢挥发到合适的浓度。（5）杂质（6）有效成分的含量越高，越易结晶。2、结晶溶剂的选择对所需成分的溶解度随温度不同而有显著差别，同时不发生化学反应；查阅相关文件，参考“相似相溶”规律；选择混合溶剂，低沸点溶剂对物质溶解度大，高沸点溶剂对物质的溶解度小；常用溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等。（六）色谱分离法1、吸附色谱利用同一吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的差异，而使各成分达到分离目的的色谱方法。吸附能力的强弱是由吸附剂和被吸附物质的性质决定的。吸附色谱法的分离效果，完全由吸附剂，溶剂和被分离物质的性质决定。（1）常用吸附剂：硅胶：多孔，微酸性，其吸附能力稍弱于氧化铝。吸附作用是由于颗粒表面有很多硅醇基，它可以和许多化合物形成氢键而具有一定的吸附作用，所以硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量有关。硅醇基还易吸附水分，吸附的水分越多，吸附其他化合物的能力越弱。吸水量超过12%就不能做为吸附剂了。当加热到了100-110℃时即可除去绝大多数硅醇基吸附的水分，恢复吸附活力，这一过程称为活化。当温度上升到500℃时，硅胶表面的硅醇基则脱水缩合转变为硅氧环结构，从而丧失吸附活性。硅胶适于分离的化合物范围很广泛，但不宜分离碱性化合物。*氧化铝由氢氧化铝直接在高温下脱水制得，带微碱性，适于分离碱性成分。聚酰胺适于分离黄酮、酚、醌类、有机酸及鞣质，可使性质极相近的化合物得到分离。原理：聚酰胺中的酰胺基可与酚羟基、羧基、羰基、硝基等形成氢键吸附。聚酰胺的吸附容量大。被分离成分的结构与吸附力的关系：1）可形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强，越难被洗脱。2）形成分子内氢键的吸附能力会减弱。3）分子中芳香化程度越高，吸附能力越强。4）对聚酰胺柱的洗脱能力，与溶剂的种类有关：甲酰胺，丙酮，甲、乙醇，水依次减弱。（2）溶剂对于极性吸附剂，溶剂极性越大，洗脱能力越强。对于非极性吸附剂，则相反。（3）被分离物质对于极性吸附剂，被分离物质的极性越强，吸附力越大，越难洗脱。（4）操作方式（1）薄层色谱：制板点样展开显色（2）柱色谱：装柱上样洗脱收集浓缩检识合并结晶（二）分配色谱1、基本原理利用物质在固定相和流动相之间分配系数不同而达到分离。2、分类正相色谱：固定相极性流动相极性，用于分离极性和中等极性的成分。反相色谱：固定相极性流动相极性，用于分离非极性和中等极性的成分3、洗脱规律：正相色谱中，极性小的化合物先被洗脱，极性大的化合物后被洗脱；反相色谱正好相反。4、常用的固定相和流动相固定相：正相色谱中常用氰基或氨基键合相；反相色谱中常用C18或C8键合相。流动相：正相色谱中主要用有机溶剂；反相色谱中常用甲醇-水或乙腈-水系