1、病原性真菌检验 临床微生物学 (第三军医大学)

弧菌和弯曲菌医学检验系临床微生物及免疫学教研室井申荣第一部分弧菌概述•弧菌科（Vibrionaseae）包括一群氧化酶阳性、具有端极鞭毛、动力阳性的细菌，有4个菌属，其中，弧菌属是一群氧化酶阳性，发酵葡萄糖，对弧菌抑制剂O/129（二氨基二异丙基喋啶）敏感的细菌。•弧菌属(Vibrio)广泛分布于自然界，尤以水中为多，有100多种。主要致病菌为霍乱弧菌和副溶血弧菌（致病性嗜盐菌）。前者引起霍乱；后者引起食物中毒。霍乱弧菌霍乱弧菌（V.cholera）是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高。属于国际检疫的烈性传染病。•霍乱弧菌包括两个生物型：古典生物型（Classicalbiotype）和埃尔托生物型（EL-Torbio-type）。这两种型别除个别生物学性状稍有不同外，形态和免疫学性基本相同，在临床病理及流行病学特征上没有本质的差别。自1817年以来，全球共发生了七次世界性大流行，前六次病原是古典型霍乱弧菌，第七次病原是埃尔托型所致。1992年10月在印度东南部又发现了一个引起霍乱流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古典型霍乱完全相同，但不能被01群霍乱弧菌诊断血清所凝集。该菌株在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长，因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株。一、生物学性状（一）形态染色•霍乱弧菌呈弧形或逗点形态，大小为1.4~2.6×0.5~0.8μm。革兰氏阴性菌，菌体一端有单根鞭毛和菌毛，无荚膜与芽胞。•取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观察，可见细菌运动极为活泼，呈流星穿梭运动。图注：霍乱弧菌的鞭毛（↑）和它可溶解的鞘膜（↑↑）负染，×3100图注：分裂中的霍乱弧菌冰冻蚀刻，×70000（二）培养特性•霍乱弧菌为需氧或兼性厌氧菌;•营养要求不高，耐碱不耐酸，在pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。因其他细菌在这一pH不易生长，故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基;•在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。•常用的选择培养基为硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板（TCBS），霍乱弧菌在其中可形成较大的菌落，因发酵蔗糖产酸而使菌落呈黄色。（三）生化反应•两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，产酸不产气。迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖。•氧化酶、明胶酶试验均阳性。•能产生靛基质，霍乱红反应阳性ElTor型霍乱弧菌与古典型霍乱弧菌生化反应有所不同•ElTor型V－P试验为阳性，能产生强烈的溶血素，溶解羊红细胞，在血平板上生长的菌落周围出现明显的透明溶血环，•古典型试验V－P试验为阴性，不溶解羊红细胞。•个别ELTor型霍乱弧菌株亦不溶血。霍乱弧菌的抗原结构特性O抗原H抗原属共同抗原＋群特异性＋－型特异性＋－耐热性（100℃2h）＋－（四）抗原性1．抗原结构：2．分群和分型：•根据O抗原的特异性，可将霍乱弧菌分成139个血清群。•根据是否与O1抗血清凝集分两大群，凡能与O1群抗血清发生凝集的称为O1群霍乱弧菌；凡不被O1群抗血清凝集的其它血清群统称为非O1群霍乱弧菌。O1群霍乱弧菌的血清分型型别别名O抗原成份原型稻叶型（Inaba）A、C异型小川型（Ogawa）A、B中间型彦岛型（Hikojima）A、B、C血清型：O1群霍乱弧菌的菌体抗原由A、B、C三个抗原成份组成•生物型：O1群霍乱弧菌有古典生物型和E1Tor生物型之分，两个生物型具有相同的血清型。我国流行以ElTor、小川型霍乱弧菌为主。•噬菌体分型：对噬菌体的敏感性进行分型，其中较为实用的是第Ⅳ组和第Ⅴ组噬菌体。霍乱弧菌两个生物型的鉴别性状古典型E1Tor型溶血（1%绵羊红细胞）－d血凝（2.5%鸡红细胞）－＋V-P试验－＋多粘菌素B敏感试验（50U/片）＋－噬菌体Ⅳ组裂解（106/ml）＋－噬菌体Ⅴ组裂解（106/ml）－＋＋９０％以上为阳性；－９０％以上为阴性；ｄ１０－８９％阳性霍乱弧菌的变异性形态变异弧型→直杆状→多形菌落变异S←→R←→L溶血性变异（ElTor型）溶血性←→非溶血性传代毒力变异强毒株←→弱毒株←→无毒株血清型别变异小川型←→稻叶型（五）变异性：（六）抵抗力•霍乱弧菌古典生物型对外环境抵抗力较弱，EL-Tor生物型抵抗力较强。•霍乱弧菌对热、干燥、日光、化学消毒剂和酸均很敏感，耐低温，耐碱而不耐酸。•霍乱弧菌对链霉素、氯霉素和四环素敏感，但ElTor生物型对一定浓度的多粘菌素B及庆大霉素有耐药性。二、致病性和免疫性1．致病物质（1）鞭毛、菌毛、粘液素酶（2）霍乱肠毒素（choleraenterotoxin）霍乱肠毒素本质是蛋白质，不耐热。对蛋白酶敏感而对胰蛋白酶抵抗。该毒素属外毒素，具有很强的抗原性。霍乱肠毒素1个A亚单位毒性单位A1肽链具有激活腺苷酸环化酶的酶活性A2肽链结合B亚单位；参与转位5个B亚单位（4～6）结合单位特异地识别肠上皮细胞膜上的神经节苷脂受体致病机理霍乱弧菌胃对酸敏感，很快被杀死肠胃酸降低或缺乏，菌体增多鞭毛、菌毛、粘液素酶绒毛上大量繁殖CT的B亚单位结合神经节苷脂受体形成膜通道A1肽链进入细胞ATP→cAMP↑肠粘膜上皮细胞分泌亢进肠液大量分泌大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻大量脱水和失盐发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡激活腺苷酸环化酶系统2．所致疾病•引起烈性肠道传染病的霍乱，为我国的法定传染病（甲类），表现为剧烈的上吐下泻，导致严重的脱水、酸中毒、痉挛、尿闭、休克和死亡。•人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食物经口传染（粪口途径）。患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”，并含大量弧菌，此为本病典型的特征。3．免疫性•患过霍乱的人可获得牢固的免疫力，再感染者少见。•病后小肠内可出现分泌型lgA。三、微生物学诊断•由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。（一）标本采集：标本以粪便为主，•一般米泔水样便采取1－3ml，成形便采取蚕豆大小。•在某些情况下，亦可采取呕吐物和尸体肠内容物作检材。检验程序（三）检验方法及鉴定1．直接镜检：1）动力观察：采取病人“米泔水样”大便或呕吐物制成悬滴片，观察细菌动力，可见流星或穿梭状动力的细菌。2）制动试验：•标本，霍乱多价诊断血清（效价1：64），用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性，•此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出。3）涂片染色：革兰氏染色阴性并成鱼群状排列的弧菌。2．快速诊断：1）免疫荧光菌球法：将标本接种于含有霍乱弧菌荧光抗体的碱性蛋白胨水中，经37℃4～6h，如有霍乱弧菌，在荧光显微镜下可见发荧光的菌球。本法适用于做大量标本的初筛。2）SPA协同凝集试验：以霍乱弧菌IgG型抗体与SPA阳性葡萄球菌结合作为试剂，与米泔水样便或增菌液作玻片凝集，立即出现明显凝集者（＋＋＋）为阳性。3．细菌分离培养1）直接分离培养：•分离用的培养基有强、弱2种选择培养基。•弱选择培养基：碱性琼脂和碱性胆盐琼脂。•强选择培养基：常用的有庆大霉素琼脂、4号琼脂和TCBS琼脂等。•现多采用碱性蛋白胨水增菌，再用强选择培养基进行分离。4．鉴定：根据霍乱弧菌在各种选择培养基上的特点，挑选可疑菌落进行鉴定。鉴定以血清学（玻片凝集）为主，结合形态学、生化反应作出判断。1）玻片凝集试验：从分离培养基上挑取可疑菌落于霍乱弧菌多价诊断血清作玻片凝集试验。诊断血清应稀释成1:32-1:64的效价使用，立即出现凝集者为阳性，同时设生理盐水和阳性细菌株对照。2）形态学检查：取纯培养物涂片革兰氏染色，观察菌体形态及染色性。用悬滴法或半固体穿刺法检测动力。3）生化反应：霍乱弧菌氧化酶试验、靛基质试验、粘丝试验和霍乱红试验均阳性。①粘丝试验：用于测定霍乱弧菌形成粘丝的特性。将0.5％去氧胆酸钠水溶液于霍乱弧菌混匀制成浓厚菌液，1min内悬液由混变清，并变得粘稠，以接种环挑取时可以拉出丝来。霍乱弧菌古典生物型和ElTor生物型均呈阳性。②霍乱红试验：出现蔷薇色，为霍乱红试验阳性。由于霍乱弧菌和其他弧菌均有此种反应，故无特异性。（霍乱弧菌含有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，霍乱弧菌液能还原硝酸盐为亚硝酸盐，因此当霍乱弧菌培养在含有硝酸盐成分的蛋白胨水中，所产生的亚硝酸盐可与吲哚结合成亚硝酸吲哚，滴加浓硫酸即可出现蔷薇色，称为霍乱红试验阳性）③O/129敏感试验：将O/129（2，4二氨基－6，7－二异丙基喋啶）药敏纸片（10－150μg）贴在接种有待测菌的琼脂平板上作纸片扩散试验，凡药物纸片周围出现抑菌环者为敏感。4）霍乱弧菌的分型鉴别试验：①血清分型：用小川型和稻叶型单价诊断血清作玻片凝集。与小川型血清凝集而与稻叶型血清不凝集者为小川型，反之为稻叶型。在两个单价血清中均有明显凝集者为彦岛型。②生物型别的鉴定：目前，两型主要依靠第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验进行鉴别，并辅以多粘菌素敏感试验、鸡红细胞凝集试验、V－P试验和溶血试验。⒈第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验：第Ⅳ组霍乱噬菌体常规稀释液（106/ml）一般仅裂解古典型，而不裂解ElTor型。⒉多粘菌素B敏感试验：取被检菌2-3h肉汤培养物点种到含药营养琼脂平板上（多粘菌素B50U／ml）,37℃培养24h，ElTor生物型生长，而古典型敏感。•⒊鸡红细胞凝集试验：在玻片上滴加生理盐水一滴，取被检菌18-24h培养物少许在盐水中制成浓厚菌悬液，然后加一滴2.5％鸡红细胞悬液，充分混匀，1min内出现凝集者为阳性，红细胞呈均匀分散者为阴性。ElTor生物型为阳性，古典型为阴性。鉴定要点：确诊O1群霍乱弧菌必须具备的条件：1、涂片为革兰氏阴性弧菌或杆菌；2、TCBS等选择培养基上典型的菌落特征；3、动力阳性；4、O1群霍乱弧菌诊断血清凝集试验阳性。四、防治原则•必须贯彻预防为主。•人群的菌苗预防接种，可获良好效果，•治疗主要为及时补充液体和电解质及应用抗菌药物如四环素、链霉素、氯霉素、强力霉素及氟哌酸类抗生素药物。第二部分弯曲菌属•弯曲菌属(Campylobacter)细菌是一类微需氧、不分解糖类、氧化酶阳性、菌体弯曲呈逗点状、S型或螺旋状、有动力的革兰氏阴性菌。•对人类致病的主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌胎儿亚种，前者是人类腹泻最常见的病原菌之一，后者在免疫功能低下时可引起败血症、脑膜炎等。•本节主要以空肠弯曲菌介绍本属的生物学特性和检验方法一、生物学性状（一）形态与染色空肠弯曲菌（C.jejuni）菌体轻度弯曲似逗点状，长1.5～5μm，宽0.2～0.8μm。菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。革兰氏阴性。图注：空肠弯曲菌的两端单鞭毛（↑）负染，×21000（二）培养特性•为微需氧菌，在含2.5～5%氧和10%CO2的环境中生长最好。最适温度为37～42℃。在正常大气或无氧环境中均不能生长。•本菌营养要求高，需加入血液、血清才能生长。•在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。（三）生化反应•空肠弯曲生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素，不液化明胶，靛基质阴性。•可还原硝酸盐，氧化酶和过氧化氢酶为阳性。•甲基红和VP试验阴性；•枸椽酸盐培养基中不生长。（四）抵抗力•抵抗力不强，易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，56℃5分钟可被杀死。•对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。但近年发现了不少耐药菌株。（五）抗原构造•本菌抗原构造与肠道杆菌一样具有O、H和K抗原。•根据O抗原，可把空肠弯曲菌分成45个以上血清型。二、致病性与免疫性•空肠弯曲菌是多种动物如牛、羊、狗及禽类的正常寄居菌。•污染食物和饮水，可引起人类急性肠炎和食物中毒，•其致病因素与肠毒素、内毒素、细胞毒素、侵袭力有关。•感染后能产生特异性血清抗体，三、微生物学诊