上皮细胞的培养

上皮细胞的培养方法上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。1、表皮细胞为例1）取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。2）置0.02%EDTA中，室温，5分钟。3）换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。4）分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5）取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。6）反复吹打，制成悬液。7）培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8）直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。2、腺上皮细胞为例：1）在含有少量培养液或Hanks液的容器中，用锋利刀片将组织反复切割成碎块。2）把组织碎块连同液体注入离心管中，再补加少许培养液，用吸管吹打片刻，置试管架3～5分钟。吸除上层液可排除非乳腺细胞部分。重复2～3次。3）末次处理结束后，向沉降管中再补加培养液，用吸管稍吹打，使沉降物重悬。不待细胞团块下降立即通过3～4层无菌纱布滤入另管中。4）调整好适宜密度，接种入培养瓶中培养。3、胃上皮细胞1）取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许。2）清洗：用含庆大霉素（400微克/毫升）和二性霉素（2微克/毫升的Hanks）液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm3大小。3）消化：在I型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消化80分钟。4）离心：收集细胞悬液，800转/分离心后，Hanks液漂洗两次。5）接种：末次离心后加入含有1％～2％胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中，接种量依不同实验目的而定。