2-蛋白质4 生物化学复习资料

2蛋白质化学一级结构(ρ41）:氨基酸序列和二硫键的位置二级结构(ρ57）：主链规律的空间排列(α-螺旋,β-折叠)超二级结构结构域（domain）三级结构(ρ70）：所有原子空间位置四级结构(ρ83）：多肽链间的相互关系维持蛋白质空间结构稳定的因素上节回顾2.1氨基酸2.2肽2.3蛋白质的分子结构2.4蛋白质结构和功能的关系2.5蛋白质的重要性质2.6蛋白质的分类2.7蛋白质的分离与鉴定2.4蛋白质结构与功能的关系一、一级结构与功能的关系(ρ49)二、空间结构与功能的关系1、一级结构的种属差异与分子进化2、一级结构的变异与分子病1、核糖核酸酶2、肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能3、疯牛病1、一级结构的种属差异与分子进化细胞色素c是一种进化上高度保守的蛋白质，在植物、动物和许多单细胞生物中存在。同源蛋白质(homologousproteins)：来自不同种类生物、而序列和功能类似的蛋白质。马不变残基：对于同源蛋白的功能是必需的可变残基：变换不影响蛋白质的功能黑猩猩响尾蛇鲤鱼蜗牛酵母蛾花椰菜羊进化距离越远，同源蛋白质的残基差异数越多。欧洲防风根据细胞色素C的顺序种属差异建立起来的进化树序列比较提供蛋白质结构与功能的信息BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)程序：程序数据库查询内容Blastp蛋白质蛋白质使用取代矩阵寻找较远的关系：可以进行SEG过滤。Blastn核苷酸核苷酸寻找较高分值的匹配，对较远关系不太适用。Blastx核苷酸(翻译)蛋白质对于新的DNA序列和ESTs的分析极为有用。Tblastn蛋白质核苷酸(翻译)对于寻找数据库中没有标注的编码区极为有用。tblastx核苷酸(翻译)核苷酸(翻译)对于分析EST极为有用。blastp:将待查询的蛋白质序列及其互补序列一起对蛋白质序列数据库进行查询；blastn:将待查询的核酸序列及其互补序列一起对核酸序列数据库进行查询；blastx:先将待查询的核酸序列按6种可读框架(逐个向前3个碱基和逐个向后3个碱基读码)翻译成蛋白质序列，然后将翻译结果对蛋白质序列数据库进行查询；tblastn:先将核酸序列数据库中的核酸序列按6种可读框架翻译成蛋白质序列，然后将待查询的蛋白质序列及其互补序列对其翻译结果进行查询；tblastx:先将待查询的核酸序列和核酸序列数据库中的核酸序列按6种可读框架翻译成蛋白质序列，然后再将2种翻译结果从蛋白质水平进行查询。使用BLAST的蛋白序列数据库：数据库描述Nr融合了Swiss-Prot,PIR,PRF以及从GenBank序列编码区中得到的蛋白质和PDB中拥有原子坐标的蛋白质，绝非多余。MonthNr的字集，每月（30天）更新，搜集了过去30天中的最新序列。SwissprotSwiss-Prot数据库。Pdb拥有三维空间结构的原子坐标的氨基酸序列库。Yeast由酵母基因组中基因编码的全套蛋白质。ecoli有大肠杆菌基因组中基因编码的全套蛋白质。一、一级结构与功能的关系(ρ49)二、空间结构与功能的关系1、一级结构的种属差异与分子进化2、一级结构的变异与分子病1、核糖核酸酶2、肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能3、疯牛病2、一级结构的变异与分子病分子病：由于基因突变导致蛋白质一级结构发生变异，使蛋白质的生物学功能减退或丧失，甚至造成生理功能的变化而引起的疾病。镰刀状细胞贫血病（常染色体隐性遗传病）形状异常的红细胞会阻塞小血管而伤及多种器官。ByLinusPaulingin1949.TraitPatient(Normal)(defective)Normal指纹图谱ByDr.V.M.Ingram，1956HbAHbSHbA:His-Val-Leu-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS:His-Val-Leu-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys双向滤纸层析－电泳-+-+水平向为电泳垂直向为层析胰蛋白酶患者的血红蛋白（表示为Hb-S）与正常人的血红蛋白（表示为Hb-A）的亚基有一个氨基酸残基不同。一、一级结构与功能的关系(ρ49)二、空间结构与功能的关系1、一级结构的种属差异与分子进化2、一级结构的变异与分子病1、核糖核酸酶2、肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能3、疯牛病1、核糖核酸酶天然状态，有催化活性非折叠状态，无活性尿素β-巯基乙醇一、一级结构与功能的关系(ρ49)二、空间结构与功能的关系1、一级结构的种属差异与分子进化2、一级结构的变异与分子病1、核糖核酸酶2、肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能3、疯牛病2、肌红蛋白（Myoglobin）和血红蛋白（Hemoglobin）的结构与功能血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线静脉血动脉血血红蛋白肌红蛋白氧分压氧饱和度别构效应(allostericeffect)：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象.•一个亚基与氧结合后，引起该亚基构象改变•进而引起另三个亚基的构象改变•整个分子构象改变•与氧的结合能力增加血红蛋白的别构效应一、一级结构与功能的关系(ρ49)二、空间结构与功能的关系1、一级结构的种属差异与分子进化2、一级结构的变异与分子病1、核糖核酸酶2、肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能3、疯牛病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。生物体内的每一个基因均受到来自生物演化的选择压，其结果是每个蛋白质均有其独特（和唯一的）的立体的结构，和生化生理功能。•蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。•这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。43%α-helix30%α-helix43%β-sheet一条肽链对应一个特定的空间结构.这条法则的破坏是灾难性的。导致疯牛病的prion就是一个例子。•疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种蛋白的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病Prion在病理组织中的纤维状聚合体2.1氨基酸2.2肽2.3蛋白质的分子结构2.4蛋白质结构和功能的关系2.5蛋白质的重要性质2.6蛋白质的分类2.7蛋白质的分离与鉴定2.5蛋白质的重要性质蛋白质的分离与鉴定两性解离及等电点胶体性质沉淀反应变性与复性紫外吸收与呈色反应沉降速度法盐析分离离子交换层析疏水层析凝胶过滤层析亲和层析蛋白质电泳-SDS丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）1、沉降速度法•用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度•蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关•沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用s表示。•一个S单位，为1×10-13秒•相对分子质量越大，S值越大•蛋白质的沉降系数：1～200S2凝胶过滤法(ρ35)葡聚糖凝胶珠基于蛋白质分子在大小和形状的差异3、蛋白质电泳——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法(ρ38)聚丙烯酰胺凝胶：大小、形状和电荷数量SDS-聚丙烯酰胺凝胶：大小带负电（SDS带负电）荷质比相同（分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少）棒状十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量双向电泳二、蛋白质的两性解离及等电点当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)。在不含任何盐的纯水中进行等电点测定，此时测得的等电点称为蛋白质的等离子点。pH=pI净电荷=0pHpI净电荷为负PrCOOHNH3++H++OH-+H++OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+pHpI净电荷为正电泳：在外电场的作用下，带电颗粒，将向着与其电性相反的电极移动。例如，不处于等电状态的蛋白质分子蛋白质在等电点时，相同电荷间的相互排斥，最不稳定，溶解度最小，极易形成沉淀析出；粘度、渗透压、膨胀性和导电能力均为最小三、蛋白质的胶体性质透析四、蛋白质的沉淀反应+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉沉淀方法类别:1、高浓度中性盐(ρ32)2、有机溶剂3、重金属盐4、生物碱试剂五、蛋白质的变性与复性(ρ78)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。2、变性的本质破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构1、蛋白质的变性(denaturation)3、蛋白质的变性伴有的表现⑴丧失生物活性⑵溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小⑶某些原来埋藏再蛋白质分子内部的疏水侧链基团暴露于变性蛋白质表面，导致光学性质变化⑷对蛋白酶降解的敏感性增大4、复性若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis变性复性核糖核酸酶变性与复性作用六、蛋白质的紫外吸收与呈色反应1、蛋白质的紫外吸收在280nm波长处有特征光吸收。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260测定范围：0.1～0.5mg/ml2、蛋白质的呈色反应α－氨基酸与水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝色反应⑴茚三酮反应(NinhydrinReaction)蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上－CO－NH－肽键的化合物都呈此反应⑵双缩脲反应(BiuretReaction)1.6蛋白质的分类按形状可分为按分子组成分为球状蛋白质纤维状蛋白质简单蛋白质结合蛋白质一、简单蛋白质简单蛋白质完全水解的产物为－氨基酸，不含其它物质二、结合蛋白质结合蛋白质＝简单蛋白质＋非蛋白质组分（辅基）糖蛋白（glycoprotein）脂蛋白（lipoprotein）色蛋白（chromoprotein）核蛋白(nucleoprotein)磷蛋白(phosphoprotein)金属蛋白（metalloprotein）1、氨基酸的侧链对多肽或蛋白质的结构和生物学功能非常重要。用三字母和单字母缩写形式列出其侧链为如下要求的氨基酸：（a）含有一个羟基。（b）含有一个氨基。（c）含有一个具有芳香族性质的基团。（d）含有分支的脂肪族烃链。（e）含有硫。2、胃液（pH＝1.5）的胃蛋白酶的等电点约为1，远比其它蛋白质低。试问等电点如此低的胃蛋白酶必须存在有大量的什么样的官能团？什么样的氨基酸才能提供这样的基团？